SALVAGE-廈門大學2021年iGEM項目課題介紹

課題：2021XMU-China

主要內(nei) 容：核電站冷卻係統中生物汙損問題的防治

關(guan) 鍵詞：貽貝、粽囊藻、生物汙損

一、背景介紹

核電作為(wei) 一種清潔能源，如今正在穩步發展之中，而海水作為(wei) 核電站的熱交換介質發揮著重要作用，但海水在湧入核電站的同時，其攜帶著的各種藻類(粽囊藻等)和貽貝等海洋生物也往往會(hui) 附著在核電站的進水口、進水管等區域，造成冷卻係統的堵塞，每年需要花費大量的精力和資金進行清理。目前，人們(men) 主要采用化學消毒的方法對汙損進行處理，但可能對環境造成破壞。研究者們(men) 主要利用合成生物學的方法，解決(jue) 球形粽囊藻和貽貝等海洋生物對核電站冷卻係統的生物汙損問題。

二、實驗設計

首先，研究者們(men) 選用需鈉弧菌作為(wei) 研究者們(men) 的底盤生物，需鈉弧菌中的基因編輯和異源表達的方法已經相對成熟，且在海水的高滲環境下，需鈉弧菌也可進行快速的生長和繁殖。

1.解決(jue) 粽囊藻繁殖問題

首先，針對球形粽囊藻。球形粽囊藻是引起赤潮的主要藻類。其一旦聚集形成種群，會(hui) 形成一層保護膜，會(hui) 大大增強粽囊藻的抵抗力，從(cong) 而使得去除更為(wei) 困難。針對這一問題，首先，研究者們(men) 將組氨酸氨解酶 HutH 釋放到球藻周圍的微環境中，將保護膜粘液中的L-組氨酸轉化為(wei) 反式尿酸鹽，從(cong) 而提高粽囊藻細胞中的活性氧(ROS)破壞藻類細胞。

此外，為(wei) 了進一步提高精確度，研究者們(men) 以細胞表麵的纖維素為(wei) 靶點，通過耦合HutH與(yu) 纖維素結合蛋白(CBM)，提高HutH對粽囊藻細胞的靶向性和殺傷(shang) 力。作用原理示意圖如圖所示。

圖1：HutH 與(yu) CBM 嵌合蛋白靶向藻類細胞表麵，殺傷(shang) 藻類細胞

為(wei) 了使研究者們(men) 的設計的更加全麵，研究者們(men) 還需解決(jue) 藻類細胞形成種群的問題，研究者們(men) 使用了SpyTag/SpyCatcher體(ti) 係以及半乳糖結合蛋白 LecA來識別並捕獲種群中藻類細胞分泌的囊泡，最終下沉到水環境底部，從(cong) 而抑製粽囊藻種群的擴大。其作用機理示意圖如圖2所示。

圖2：LecA 識別球藻表麵的半乳糖並利用 SpyTag/SpyCatcher 體(ti) 係聚集沉降

2.解決(jue) 貽貝的粘附問題

接著，針對貽貝的粘附問題，通過其作用機理的調研，研究者們(men) 發現，貽貝可牢牢粘附在固體(ti) 表麵並分泌貽貝粘附蛋白(Mfp)，Mfp側(ce) 鏈中含有大量的DOPA(多巴)，可與(yu) 金屬表麵形成氫鍵，促進貽貝與(yu) 固體(ti) 表麵的相互作用。其次，貽貝的足絲(si) 還可釋放脂肪酸，為(wei) Mfp的作用提供疏水環境，進一步促進貽貝的粘附作用。因此，針對作用機理，研究者們(men) 設計的工程菌必須抑製貽貝足絲(si) 的形成，去除脂肪酸，消除 DOPA 的作用。

首先，針對DOPA與(yu) 金屬表麵形成氫鍵的問題，研究者們(men) 利用多酚氧化酶(PPO)的釋放，將 DOPA轉化為(wei) 多巴醌，即將兩(liang) 分子的DOPA通過羥基形成的氫鍵相連，從(cong) 而阻止DOPA與(yu) 冷卻係統中的金屬表麵形成氫鍵。其次，研究者們(men) 利用了TnaA-his功能酶，將合成足絲(si) 所需的色氨酸轉化為(wei) 吲哚，進而抑製足絲(si) 的形成。最後，研究者們(men) 利用銅綠假單胞杆菌所產(chan) 生的RhlA和RhlB兩(liang) 種生物洗滌劑來去除足絲(si) 釋放的脂肪酸，具體(ti) 的效應機製如圖3所示。

圖3：足絲(si) 的粘附和RhlA/RhlB，PPO的效應機製

3.信號肽和表麵修飾係統

首先，為(wei) 了確保需鈉弧菌表達的目的蛋白的釋放，研究者們(men) 設計了兩(liang) 種信號肽--Aly01/LMT(信號肽LMT由研究者們(men) 自主設計)，幫助將目的蛋白轉運到細胞外環境中。如圖4所示。

圖4：信號肽 Aly01/LMT 幫助運送目的蛋白到細胞外環境中

接著，對於(yu) 表麵展示係統，研究者們(men) 選擇了以下三種蛋白：LCI KR-2、OmpA和LamB。其中，LCI KR-2是一種來源於(yu) 枯草芽胞杆菌的多肽突變體(ti) ，具有很強的聚丙烯吸附能力，而OmpA和 LamB兩(liang) 種蛋白作為(wei) 錨定蛋白，提供細胞表麵展示的支架，可將LCI KR-2錨定到需鈉弧菌表麵。因此，研究者們(men) 隻需在冷卻係統的格柵上塗上聚丙烯，表麵展示LCI KR-2的需鈉弧菌就可牢牢吸附在格柵表麵，分泌PPO等功能酶，抑製貽貝的粘附作用。表麵展示的作用機理如圖5所示。

圖5：表麵展示有 LCI KR2 的需鈉弧菌可牢牢吸附在塗有聚丙烯的格柵上

4.自殺係統的設計

由於(yu) 核電站的冷卻係統直接與(yu) 海洋相連，可能存在工程菌泄露的危險，因此，研究者們(men) 設計了一個(ge) 基於(yu) 光遺傳(chuan) 係統的生物反應終止開關(guan) ，避免工程菌逸散到生態係統中。研究者們(men) 在冷卻係統的出水口鋪設了藍光光源，當工程菌在黑暗的水環境中時，可正常工作，而當工程菌進入出水口時，研究者們(men) 啟用藍光誘導的啟動子，激活自殺開關(guan) ，使得工程菌在進入自然環境之前死亡。

研究者們(men) 選擇了基於(yu) 細菌轉錄因子EL222的光遺傳(chuan) 回路。該回路具有誘導條件簡單，響應時間快、對藍光強度高度敏感等優(you) 點，EL222是一種藍光激活的DNA結合蛋白，具有光敏結構域LOV和HTH(helix-turn-helix)結構域。當藍光照射時LOV結構域被激活並引發光化學反應，使得EL222分子二聚化，二聚化的EL222分子可激活啟動子pBlind，促進下遊基因的轉錄。為(wei) 了加強正反饋調節，研究者們(men) 設計了pBLind-EL222-pBLind-blrA藍光誘導係統，使得pBLind在被激活後可進一步促進EL222的表達。

BlrA作為(wei) 下遊的毒力蛋白，是一種藍光誘導的 GTP受體(ti) ，同時也是一種來源於(yu) 枯草芽孢杆菌的黃素結合熒光蛋白。在正常情況下，BlrA對細胞沒有毒性，而當暴露在藍光下時，BlrA作為(wei) 光敏劑，可產(chan) 生大量的活性氧(ROS)，從(cong) 而殺死細胞。藍光密度必須大於(yu) 90mW/cm2，治療時間應大於(yu) 10秒，才能達到相對較高的死亡率。其具體(ti) 作用機理如圖6所示。

圖6：BlrA 蛋白的激活和表達機製

三、實驗過程

由於(yu) 研究者們(men) 的項目與(yu) 貽貝相關(guan) ，我重點閱讀了解決(jue) 貽貝部分的實驗過程。首先，研究者們(men) 設計了基因回路(圖7)並將重組質粒轉化到大腸杆菌 DH5α中，經過菌落PCR驗證後進行培養(yang) 擴增，然後再利用電穿孔的方法導入需鈉弧菌中，利用菌落PCR和DNA測序判斷是否導入成功。

後續研究者們(men) 再利用特定時間內(nei) 由色氨酸轉化為(wei) 吲哚的含量判斷tnaA酶的活性接著，研究者們(men) 再驗證了PPO的表達，研究者們(men) 使用T7啟動子進行誘導，經過SDS-PAGE驗證後發現PPO在大腸杆菌和需鈉弧菌中均可成功表達。後續再測量多巴醌的吸光度，計算酶活性。

總的來說，研究者們(men) 們(men) 利用以大腸杆菌DH5α為(wei) 中間載體(ti) ，現將重組質粒導入到大腸杆菌中，驗證其可成功表達後再導入到需鈉弧菌中進行驗證。

圖7：tnaA-his 基因回路