2023 HUST-China iGEM課題分享

獲獎情況

在2023年iGEM大賽中，HUST-China榮獲金獎並斬獲TOP10大獎以及最佳氣候危機課題、最佳綜合HP、最佳展示、最佳合成線路、iGEM全場人氣獎、最佳項目宣傳(chuan) 視頻、最佳硬件提名和最佳網頁提名八項單項獎項。

一、背景

大氣中CO2 等溫室氣體(ti) 可以吸收來自太空和地球表麵的長波輻射，使得低層大氣和地球表麵溫度升高，導致全球變暖。 以火電廠為(wei) 主導的能源供應模式貢獻了化石燃料燃燒產(chan) 生的CO2 排放總量的42.7%，顯著加劇了溫室效應，加重可能存在的全球性問題，包括幹旱、海平麵上升、極端氣候、糧食減產(chan) 、疾病傳(chuan) 播等，進一步危機人類安全和健康。

因此，華中科技大學的團隊希望利用合成生物學將集胞藻PCC6803（Synechocystis sp. PCC6803）和希瓦氏菌MR-1（Shewanella oneidensis MR-1）進行改造，使其形成的共培養(yang) 體(ti) 係能夠將發電廠廢氣中的CO2轉化為(wei) 乳酸並利用其進行微生物發電。 他們(men) 希望通過這一設計應對氣候危機，解決(jue) 溫室氣體(ti) 排放量大的明顯現狀，改善火電廠的低能效，標本兼治。

二、原理

1.藍藻碳代謝途徑

在集胞藻PCC6803中，依靠光合機器提供的ATP和NADPH，二氧化碳經過卡爾文-本森循環以多糖形式儲(chu) 存並代謝成各種化合物，這些化合物可用於(yu) 細胞呼吸的TCA循環中，也可進入代謝旁路，但是集胞藻屬PCC 6803本身並缺乏由丙酮酸產(chan) 生乳酸的途徑。

圖1 集胞藻PCC6803碳代謝途徑

2.希瓦氏菌NAD+ 生物合成的網絡

細胞中NAD（H/+）（即 NADH 和 NAD+ 的總水平）是細胞內(nei) 電子的重要來源，細胞內(nei) 的電子可以通過電活性微生物細胞外電子轉移（EET）途徑從(cong) 中轉移到細胞外電子受體(ti) 。 細胞內(nei) NAD（H/+） 的增加導致更多的電子從(cong) 電子供體(ti) 的氧化增加轉移到EET通路，從(cong) 而增強細胞內(nei) 電子通量和 EET 速率。

圖2增強希瓦氏菌MR-1 中 NAD+ 生物合成和 EET 速率的模塊化設計示意圖（綠色與(yu) 深棕色模塊示意希瓦氏菌MR-1原本NAD+合成途徑）

而希瓦氏菌NAD+ 生物合成的網絡結構有：

模塊 1 ：通過同化 L-天冬氨酸進行從(cong) 頭生物合成。

模塊 2 ：前體(ti) Na（煙酸）和 Nm（煙酰胺）的挽救性生物合成。 希瓦氏菌 MR-1 可以同化 Nm 作為(wei) 前體(ti) ，但不能使用 Na 作為(wei) 前體(ti) ，因為(wei) 缺乏將 Na 轉化為(wei) 煙酸單核苷酸 （NaMN） 的酶。

模塊 3：從(cong) 頭和挽救性生物合成途徑的共同部分的通用生物合成。 希瓦氏菌不能直接從(cong) 煙酰胺單核苷酸（NMN）合成NAD+，而隻能通過從(cong) NMN到NaMN再到煙酸腺嘌呤二核苷酸（NaAD）的迂回途徑合成NAD+。

3.GSH代謝途徑

穀胱甘肽是一種三肽化合物，由穀氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成。 它以兩(liang) 種形式存在：GSH 和 GSSG。 還原形式 （GSH） 可以進行氧化以維持細胞內(nei) 細胞環境處於(yu) 還原狀態。 由此產(chan) 生的穀胱甘肽二硫化物——氧化形式 （GSSG） 可以通過穀胱甘肽還原酶再次還原為(wei) GSH。 GSH是由γ-穀氨酰半胱氨酸合成酶（GshA）和穀胱甘肽合成酶（GshB）的連續相互作用合成的。 GshA以穀氨酸和半胱氨酸為(wei) 底物合成中間產(chan) 物γ-穀氨酰半胱氨酸，然後加入GshB。

圖3 穀胱甘肽代謝途徑（γ-穀氨酰循環）

4.損傷(shang) 抑製因子 （Dsup）的DNA保護機製

Dsup是一種具有緩步動物損傷(shang) 抑製活性的特定蛋白質，以保護 DNA 免受輻射和自由基損傷(shang) 。

其優(you) 點在於(yu) ：

①本質上無序，使得 Dsup 能夠調整其結構以適應 DNA 形狀並與(yu) DNA 互補結合。

②有大量的帶電殘基，淨電荷為(wei) 正的Dsup與(yu) 淨電荷為(wei) 負的DNA之間存在較強的靜電吸引力，可以更好地形成蛋白-DNA聚集體(ti) 以保護DNA。

Ⅲ. Design

為(wei) 了使得共培養(yang) 體(ti) 係能夠有效的進行碳封存和發電，他們(men) 將設計分為(wei) 三個(ge) 部分：

一.使集胞藻屬PCC 6803可以產(chan) 生乳酸並將乳酸轉運至胞外作為(wei) 希瓦氏菌發電的碳源。

二.改造希瓦氏菌使其增強胞內(nei) NAD（H/+）合成，以提高EET速率發展生物燃料電池。

三.保證工程菌在強氧化廢氣的惡劣環境中生存。

1.乳酸生產(chan) 及轉運線路

團隊通過在在聚胞藻屬PCC 6803中引入ldhA 與(yu) lldP兩(liang) 個(ge) 基因分別表達乳酸脫氫酶和乳酸轉運蛋白，使其能夠催化丙酮酸加氫產(chan) 生乳酸並將產(chan) 生的乳酸轉運到生物體(ti) 的細胞外層。由於(yu) 乳酸脫氫酶以NADH分子作為(wei) 輔酶，而集胞藻屬PCC 6803光合作用產(chan) 生的NADPH分子遠遠超過分解代謝產(chan) 生的NADH分子。為(wei) 了提高NADH/NADPH比值，他們(men) 又導入omcS基因，編碼C型外膜細胞色素的氧化還原蛋白，使得光合電子傳(chuan) 遞鏈中多餘(yu) 的電子從(cong) PQ 引導到 PSI 從(cong) 而產(chan) 生三種效果：

（1）提高CET（循環電子傳(chuan) 遞），增加ATP的產(chan) 生。

（2）改善LET（線性電子傳(chuan) 遞），增加光反應過程中ATP和NADPH的產(chan) 生。

（3）抑製RET（呼吸電子傳(chuan) 遞），使NADH能夠積累，從(cong) 而提高乳酸脫氫酶活性。否則將被呼吸產(chan) 生ATP，從(cong) 而導致NADH水平增加。

圖4OmcS對中樞代謝基因表達的影響

圖5 乳酸生產(chan) 基因線路

2.希瓦氏菌胞內(nei) NAD（H/+）合成增強

為(wei) 了能夠同時吸收和代謝Na和Nm，他們(men) 引入了Na和Nm的雙功能轉運蛋白niaP的基因和編碼煙酸磷酸核糖轉移酶ycel的基因pncB；他們(men) 還引入了編碼NMN腺苷酸轉移酶的基因nadM，直接將NMN轉化為(wei) NAD+。

此外，他們(men) 導入大腸杆菌的編碼NAD+合酶的基因nadE*和編碼煙酸單核苷酸腺苷酸轉移酶的基因nadD*，原因是其能夠更加高效合成NAD+。

間接電子轉移由內(nei) 源性分泌的可溶性電子穿梭黃素介導。為(wei) 了增加核黃素從(cong) 希瓦氏菌MR-1的擴散，他們(men) 引入了孔蛋白Oprf對應基因oprf，以增加核黃素在細胞膜上的轉運，從(cong) 而進一步提高發電能力。

圖6胞內(nei) NAD（H/+）合成增強和核黃素擴散基因線路

3.抗逆性線路設計

團隊考慮到發電廠廢氣強氧化性對細胞生長不利，因此在集胞藻PCC6803中引入了超氧化物歧化酶（SOD）的sodA基因並過表達基因 GshA 和 GshB提高胞內(nei) 穀胱甘肽水平增強工程菌抗氧化性。

針對希瓦氏菌MR-1，他們(men) 同樣導入sodA基因並增加dsup基因表達以保護DNA免受輻射和自由基損傷(shang) 。

圖7集胞藻PCC6803抗逆基因線路

圖8希瓦氏菌MR-1抗逆基因線路

Ⅳ. Result

1.工程集胞藻PCC 6803表達驗證

工程集胞藻PCC6803生長狀況

用BG11分別培養(yang) 工程菌聚胞藻 PCC 6803（omcs）和野生型，並測定OD730每 24 小時一次。集胞藻 PCC 6803（omcs）在各階段的細胞濃度均有顯著改善，生長速率無明顯下降，表明omcs可以通過增加ATP合成來提高PSI的光合效率，從(cong) 而促進細胞的更好生長。

圖9BG11中聚胞藻PCC 6803和聚胞藻PCC 6803（omcs）的生長曲線

乳酸生產(chan) 驗證

首先測量了乳酸濃度的標準曲線並確定了其保留時間，再采用凍融法破碎集胞藻PCC6803（pLactate）細胞，取離心後的上清液進行高效液相色譜（HPLC）證實了乳酸在工程細菌中的成功表達及穩定地產(chan) 生。

圖10 聚胞藻 PCC 6803、聚孢子蟲PCC 6803（omcs）和5mM乳酸標準品的HPLC譜圖。結果表明，集胞藻屬PCC 6803（omcs）可以產(chan) 生乳酸而野生型則不具備這種能力。

2.工程希瓦氏菌MR-1表達驗證

NADH/NAD+濃度的測定

分別測量了野生型和工程菌株 ycel-pncB 和 nadD-nadE-nadM 的 NADH/NAD+ 含量，均有不同程度增加。

希瓦氏菌MR-1 （ycel-pncB） 可能有助於(yu) 加速煙酸和煙酰胺的轉運以進行細胞內(nei) NADH 合成，而 S. oneidensis MR-1（nadD-nadE-nadM） 促進更有效的電子轉移。

圖11.oneidensis MR-1（野生型）、（ycel-pncB）、（nadE-nadD-nadM）的NAD（H/+）濃度

希瓦氏菌發電量驗證

他們(men) 建立了一個(ge) 微生物燃料電池裝置，培養(yang) 條件下外源加入乳酸並加入 0.1 mM IPTG 誘導劑以啟動基因表達，使用數字萬(wan) 用表測量微生物燃料電池的輸出電壓。相比之下，與(yu) 野生型相比，nadD-nadE-nadM表現出顯著更高的放電峰值和更長的高效放電持續時間。最高輸出電壓高達150.7 mV，最高功率輸出增加42.32%。

圖12陽極溶液為(wei) M9緩衝(chong) 液和18mM乳酸時，S.oneidensis MR-1、S.oneidensis MR-1（ycel-pncB）、S.oneidensis MR-1（nadD-nadE-nadM）的輸出電壓

外源電子載流子選擇

他們(men) 研究了添加光敏劑（5 μM曙紅Y，5 μM熒光素）和40 μM核黃素對S. oneidensis MR-1（nadD-nadE-nadM）發電的影響。結果表明，核黃素有助於(yu) 發電。

圖13不同外源電子載流子的輸出電壓

實際應用

將含有 S. oneidensis MR-1、S. oneidensis MR-1（ycel-pncB）、S. oneidensis MR-1（nadD-nadE-nadM）基因通路的微電池分別與(yu) 紅色 LED 燈泡連接起來。結果表明，與(yu) S. oneidensis MR-1微電池連接後，LED燈泡的亮度沒有明顯變化，表明S. oneidensis MR-1微電池未達到LED燈泡的工作電壓，而工程菌組中的紅色LED燈泡可以正常使用並發出明亮的紅光。

3.共培養(yang) 係統

工程菌生長狀況

分別使用MBG11培養(yang) 基培養(yang) 集胞藻PCC 6803和S. oneidensis MR-1，每24小時測量一次OD值，並得到如下生長曲線。MBG11培養(yang) 可以使集胞藻正常生長。希瓦氏菌 MR-1目前可以生長，但生長速度緩慢，造成這一結果的原因可能是缺乏營養(yang) 。

圖14 聚胞藻 PCC 6803和聚胞藻 PCC 6803（omcs）在MBG11中的生長曲線。集胞藻 PCC 6803（omcs）在各個(ge) 階段的細胞濃度均有顯著提高，生長速度更穩定

圖15MBG11中希瓦氏菌MR-1（野生型）、（ycel-pncB）、（nadD-nadE-nadM）的生長曲線

發電狀況

使用 MBG11 培養(yang) 基測量希瓦氏菌在對數生長階段的發電性能，其在含乳酸的MBG11培養(yang) 基中可以正常發電。

圖15MBG11中希瓦氏菌MR-1（野生型）、（ycel-pncB）、（nadD-nadE-nadM）的輸出電壓

Ⅵ. Hardware

他們(men) 提出“積木式”發酵罐的模塊化設計思路，提高了發酵係統的操作便攜性和環境適應性，並針對不同發酵場景定製了相應的解決(jue) 方案，確保效率最大化。

工業(ye) 化設計時他們(men) 考慮到轉化時的各種實際情況，包括成本、操控方法、地理條件以及如何達到實驗室效果等問題進行合理改進。

圖16 整體(ti) 裝配圖（左）和工業(ye) 設計圖（右）

Ⅴ. HP

HUST-Cina團隊在武漢科技館進行一場關(guan) 於(yu) 合成生物學的兒(er) 童科學講座，形象化地介紹了合成生物學的基礎知識以及與(yu) 該項目相關(guan) 的具體(ti) 知識，並讓孩子們(men) 在“合成質粒”的遊戲中理解掌握有關(guan) 基因工程的知識。

他們(men) 還在校園內(nei) 組織了一場麵向中學生的夏令營，向他們(men) 介紹合成生物學的基本概念，並提供基本微生物實驗的指導。

另外，他們(men) 還匯集華中農(nong) 業(ye) 大學不同學科的同學組織了一場有關(guan) 合成生物學倫(lun) 理的辯論，為(wei) 不同的觀眾(zhong) 提供合成生物學的基礎知識，並促進與(yu) iGEM團隊HZAU-China的有意義(yi) 的討論。

課題亮點

1.以兩(liang) 種菌共培養(yang) 的方式將火力發電廠產(chan) 生的二氧化碳轉化為(wei) 電能，同時使用火力發電過程中的浪費熱能培養(yang) 工程菌。兩(liang) 種工程菌在空間上是隔離的但是他們(men) 之間又以乳酸作為(wei) 中介物質聯係並且處於(yu) 同一培養(yang) 基體(ti) 係中，避免了培養(yang) 基不同造成的生長障礙。

2.考慮到抗逆的基因線路，讓他們(men) 的設計更加完整。實驗的成果完成度也比較高。采用了MFC設計想法，並且在實驗過程中做出了模型模擬，證明了用工程微生物發電的可行性。

3.人類實踐的辯論賽和夏令營活動都非常有創意，值得學習(xi) 。