PRYSM-新加坡國立大學2021年iGEM項目課題分享

XMU-iGEM 2024課題分享

1、課題標題

PRYSM——2021年NUS_Singapor

2、課題背景

新加坡國土麵積小導致耕種和農(nong) 用麵積極小，存在著嚴(yan) 重的糧食問題，農(nong) 產(chan) 品依賴大量進口。相比於(yu) 水平種植，垂直種植在同等麵積上的生產(chan) 量為(wei) 20 倍。COVID-19 擾亂(luan) 了全球食品供應鏈，暴露了新加坡食品供應鏈的脆弱性，其中 98%的食品是進口的。隨著新加坡努力實現到 2030 年本國生產(chan) 30%食品消費的國家目標，不斷增加的農(nong) 場對適當害蟲防治的需求將會(hui) 激增。合成農(nong) 藥仍然被認為(wei) 是害蟲防治的黃金標準。

然而，對合成農(nong) 藥對環境/健康的負麵影響的擔憂限製了它們(men) 的使用。生物抗菌肽已被確定為(wei) 潛在的替代品，但利用現有的生物生產(chan) 方法，生產(chan) 用作生物農(nong) 藥的此類化合物在經濟上是不可行的。該項目旨在使用更具成本效益的方法生產(chan) 人類β防禦素，在農(nong) 場用作生物殺菌劑/殺真菌劑，通過開發光遺傳(chuan) 學控製的酵母底盤和專(zhuan) 為(wei) 該底盤設計的開源生物反應器來實現。

課題原理

團隊設計的 PRYSM 生物製造係統利用光遺傳(chuan) 學將硬件和生物係統連接起來，以精確控製工程釀酒酵母的3個(ge) 關(guan) 鍵功能：紅光誘導酵母產(chan) 生和分泌生物農(nong) 藥：人類β防禦素；藍光誘導酵母絮凝，使它們(men) 聚集和沉澱，以便於(yu) 提取肽；同時使用紅光和藍光可激活基於(yu) 核酸酶的終止開關(guan) ，實現對提取的培養(yang) 基進行滅菌，並增加生物安全的絕緣層。

設計原理：人類β防禦素屬於(yu) 抗菌肽（AMPs），對廣譜微生物具有非酶抑製作用。肽帶正電荷而與(yu) 帶負電荷的細胞膜成分（例如磷脂）進行靜電相互作用，增加膜通透性並導致細胞死亡。目前已證明功能性重組 HBD2 使用釀酒酵母表達；大多數關(guan) 於(yu) AMP 和 HBD2 的工作都集中在治療領域；HBD2 是人體(ti) 原生的，對人體(ti) 非常安全。

綜上，該團隊選擇使用人類 β防禦素2（HBD2）作為(wei) 主要候選藥物釀酒酵母作為(wei) 生物生產(chan) 和食品生產(chan) 中大量使用的 GRAS 生物模型，是生產(chan) 人類β防禦素的理想底盤生物。絮凝是指在啤酒酵母中最常見的一種現象。發酵後，酵母會(hui) 聚集並沉入桶底，由蛋白質Flo1 的產(chan) 生和分泌誘導。

酵母表麵的 Flo1 蛋白與(yu) 其他酵母細胞壁中的甘露糖殘基結合，導致聚集。絮凝比傳(chuan) 統的固液分離方法（如過濾、離心或沉澱）更具成本效益。將限製可能最終進入產(chan) 品的轉基因生物的數量，從(cong) 而增加額外的生物安全水平。

實現方式

該團隊創建了一個(ge) 轉基因酵母底盤（如圖 1），受到光遺傳(chuan) 學控製以誘導人類β-防禦素2 表達或啟動絮凝，具體(ti) 取決(jue) 於(yu) 酵母所暴露的光的波長。該團隊還通過“智能”生物反應器創建了光遺傳(chuan) 學細胞-機器接口係統，將與(yu) 酵母培養(yang) 物接口，以確定啟動生產(chan) 過程的不同階段。

圖1 NUS_Singapore 團隊設計的全基因回路

圖2 全基因回路中的組件具體(ti) 組成

該團隊依賴自主開發的三個(ge) 合成啟動子以及一個(ge) 在 PhiReX 係統中開發的啟動子，實現藍光和紅光雙通道係統。藍光啟動子 3C120-CYCp-LacO 由 CYC1 啟動子組成，包含三個(ge) C120 重複序列（EL222 的結合位點）和下遊的 lacO 序列。這種結構允許 EL222 二聚體(ti) 激活啟動子，而 LacI 蛋白抑製啟動子。3C120-CYCp 是缺少 lacO 序列的變體(ti) 。tet 抑製啟動子 ，PGK1-tetO 來自酵母 PGK1 啟動子，與(yu) 其 TATA box 下遊的 tetO 序列融合。

如果產(chan) 生了TetR，啟動子將被抑製。Jub1.1 啟動子包含4個(ge) Jub1.1 序列是 SynTALE 蛋白的結合靶標。當 SynTALE-PhyB 和 PIF3-VP64 暴露在光下時，與(yu) PIF3 融合的 VP64 激活結構域與(yu) 截短的 CYC1 啟動子非常接近。pAND 通過將 PhiReX 係統中的 Jub1.1 序列與(yu) 截短的 CYC1啟動子融合到下遊 lacO 序列中，使其在紅光下以與(yu) Jub1.1 啟動子相同的方式被激活。

利用雙激活-去抑製回路實現緊密的感應折疊。EL222-VP16 由 ACTp 組成，黑暗中EL222 無活性，PGK1-TetO 啟動子表達的 LacI 抑製 3C120-CYCp-LacO 的泄漏。當存在藍光時，EL222 二聚化並激活 3C120-CYCp，驅動 TetR 的表達，從(cong) 而抑製 PGK-TetO，抑製 LacI 的表達並去抑製 3C120-CYCp-LacO，允許激活的 EL222 驅動 Flo1 的表達。

為(wei) 了提高藍光啟動子的整體(ti) 表達，該團隊實施了前饋電路（如圖 3），當存在藍光時，正反EL222 的正反饋將酵母的代謝通量轉移到 3C120-CYCp 基序上，補充雙重壓製係統。

圖3 藍光感應增加 EL222 表達的前饋回路

紅燈開關(guan) ：利用分裂蛋白框架（如圖 5），PhyB-SynTALE 和 PIF3-VP64 在紅光下相互作用，使 VP64 與(yu) Jub1.1 啟動子靠近。來自 A. thaniliana 的異源血紅素氧化酶（HY1）

和來自集胞藻屬的膽蛋白還原酶（PcyA）合成，使該係統能夠在紅光存在下完全激活 Jub1.1。

圖4 紅光感應係統開關(guan) 的部分基因回路

AND 門控終止開關(guan) ：終止開關(guan) 與(yu) pAND 啟動子相連，在藍光和紅光同時存在時才能激活。在藍光存在下，pAND 中的 lacO 序列將被解壓，但不會(hui) 被激活來驅動轉錄。在紅光存在下，pAND 中的 Jub1.1 序列被激活，但轉錄仍被 LacI 抑製。隻有當藍光和紅光同時存在時，LacO 才會(hui) 被解壓並被激活 pAND，從(cong) 而驅動核酸酶殺傷(shang) 開關(guan) 的表達。

人類實踐

新加坡國立大學 iGEM 團隊在過去的一年裏，一直在努力與(yu) 與(yu) 此問題相關(guan) 的每個(ge) 可能的利益相關(guan) 者進行交談，以滿足參與(yu) 農(nong) 業(ye) 過程的每個(ge) 利益相關(guan) 者的需求——從(cong) 農(nong) 民和研發科學家到監管機構和消費者，確保 PRYSM 不僅(jin) 僅(jin) 是一個(ge) 理論上的科學解決(jue) 方案。PRYSM 滿足了新加坡同胞的需求，幫助向自力更生的食品未來邁出了一步。

1.了解當地的蟲害問題

自“30 by 30”目標開始以來，城市農(nong) 場持續發展，每個(ge) 農(nong) 場都在努力滿足營養(yang) 需求。這些農(nong) 場使用各種技術和害蟲防治解決(jue) 方案，但在大多數情況下，它們(men) 都是“有機”的。該團隊與(yu) 島上的農(nong) 場（如圖 6）交流了解到：為(wei) 了保持可持續的耕作方式並滿足消費者的需求，新加坡的大多數城市農(nong) 場都符合這一耕作標準，隻使用天然殺蟲劑，如印楝油、辣椒油。

圖5 NUS_Singapore 團隊聯係的農(nong) 場

為(wei) 了解城市農(nong) 場的問題以及食品供應鏈的差距，該團隊聯係了當地的垂直草莓農(nong) 場Singrow。與(yu) 一位農(nong) 場技術人員進行交談，技術人員現場介紹了白粉病並表明該農(nong) 場不使用商業(ye) 合成殺蟲劑來解決(jue) 。他們(men) 嚐試使用印楝油等有機殺蟲劑，使用矽藻土等預防，但效率很低；采用受控環境農(nong) 業(ye) （CEA）係統，但啟動和維護成本太高，且會(hui) 推高其產(chan) 品的價(jia) 格。

他們(men) 采訪了主要利益相關(guan) 者——農(nong) 民，來驗證新加坡農(nong) 場對白粉病解決(jue) 方案的需求。他們(men) 從(cong) 當地大型和小型農(nong) 場以及采用不同耕作技術的農(nong) 場尋求專(zhuan) 家，包括室內(nei) 水培農(nong) 場、室內(nei) 土壤農(nong) 場、屋頂水培農(nong) 場和室外土壤農(nong) 場。該團隊了解到：所有農(nong) 場，尤其有機農(nong) 場，都需要一種生物解決(jue) 方案以控製白粉病等真菌病原體(ti) 的傳(chuan) 播。它必須有效，且解決(jue) 有關(guan) 其安全性、成本和可持續性的問題。

2.定義(yi) 好的解決(jue) 方案

鑒於(yu) 資源和時間有限，該團隊優(you) 先考慮大多數當地農(nong) 場所需資源。農(nong) 場的生物農(nong) 藥需求可以歸納為(wei) 8 個(ge) 關(guan) 鍵：有效對抗各種微生物病原體(ti) ；安全獲得新加坡食品局（SFA）的批準；一種生物製品，可用於(yu) 有機農(nong) 場；無外來遺傳(chuan) 物質；成本低廉；經濟高效的純化；係統能根據農(nong) 場中存在的害蟲類型生產(chan) 殺蟲劑；易於(yu) 操作。後續該團隊谘詢了新加坡市場上現有的害蟲解決(jue) 方案以及市場空白。新加坡食品局（SFA）監管和注冊(ce) 用於(yu) 種植新加坡消費作物的農(nong) 業(ye) 農(nong) 藥。為(wei) 開發更安全生物農(nong) 藥，尋找天然存在於(yu) 人體(ti) 內(nei) 的抗菌蛋白或可安全食用的抗菌蛋白，但生產(chan) 成本高。

除此之外，他們(men) 向轉基因谘詢委員會(hui) （GMAC）尋求監管信息。GMAC 評估了轉基因生物研究和向環境中釋放的風險，以及將修飾基因整合到其他物種中的風險。對於(yu) 生物生產(chan) 研究，他們(men) 強調了生物反應器設計對確保生物安全的重要性。

3.構思解決(jue) 方案

他們(men) 谘詢了基因工程和硬件設計領域的專(zhuan) 家，並根據他們(men) 的反饋迭代改進了設計，以達到最終解決(jue) 方案旨在實現的不同設計原則。

他們(men) 從(cong) Singrow 的 Bao Shengjie 博士得到生物反應器設計的要求，必須考慮硬件的總體(ti) 成本。因而他們(men) 決(jue) 定將 POC 設備縮小到台式規模，總工作體(ti) 積為(wei) 100 mL，以確保成本低，更換零件的可及性很高。並使用紅外溫度傳(chuan) 感器進行精確的溫度檢測，使用紅外二極管和檢測器係統進行 OD 測量。

他們(men) 從(cong) Addison Wong 博士那裏得知純化是生產(chan) 過程中成本最高的步驟。因而他們(men) 的生物反應器采用了振蕩曝氣方式，使酵母菌株有效絮凝。通過結塊和沉澱過程，絮凝使修飾的酵母沉入燒瓶底部，上清液幾乎不含細胞，從(cong) 而減少昂貴純化費。

4.實施和評估

為(wei) 了了解消費者對農(nong) 藥使用的厭惡，該團隊在新加坡當地社區設計了一項消費者態度調查，以了解他們(men) 對生物農(nong) 藥與(yu) 商業(ye) 農(nong) 藥相比的開放程度和看法。超過一半的受訪者對在農(nong) 作物中使用傳(chuan) 統農(nong) 藥表示擔憂， 80%的受訪者對使用生物農(nong) 藥持開放態度。結果表明，雖然生物農(nong) 藥越來越常見，但仍有消費者有擔憂，他們(men) 強調需要適當的公眾(zhong) 教育活動。

5.教育

與(yu) 南洋理工大學（NTU）iGEM 合作，組織研討會(hui) μBioMachines。μBioMachines 麵向大學預科生，旨在向大學預科生推廣合成生物學的基礎知識，使其成為(wei) 新興(xing) 領域。他們(men) 與(yu) 新加坡國立初級學院（NJC）合作，並將該活動推廣到新加坡的其他中學機構。他們(men) 為(wei) 該活動的不同年齡受眾(zhong) 設計了不同 PPT，激發學生在進一步的學術追求中追求合成生物學。

他們(men) 組織了“構建自己的電路”活動用於(yu) 模擬 BioBricks 概念，創建了 Miro 板，允許根據給定的不同條件在設計電路時進行遠程協作。該係統易於(yu) 修改，並且可以輕鬆擴展以包括更複雜的問題，作為(wei) 協作探索 BioBricks 概念的工具。

該團隊成員還與(yu) 參加合成生物學、BN4501 工程生物學等不同 LSM3246 課程的學生進行了簡短的分享會(hui) 和講座，並概述現實生活中的合成生物學應用，解釋 iGEM 的內(nei) 容。

經過人類實踐訪談和消費者調查，該團隊發現消費者對生物農(nong) 藥及其安全性的認識存在差距。通過研究和外展，他們(men) 意識到更好的意識和教育可以影響生物農(nong) 藥進入新加坡市場並製作了一個(ge) 簡短的、內(nei) 容豐(feng) 富的視頻，說明了什麽(me) 是生物農(nong) 藥，以及它們(men) 如何作為(wei) 一種環保、人類友好、商業(ye) 化的農(nong) 藥替代品。

在進行綜合人類實踐時，他們(men) 谘詢了 Vaciome，一家專(zhuan) 門從(cong) 事 AMP 發現和生產(chan) 的合成生物初創公司。通過討論發現該公司有一個(ge) 用於(yu) 畢赤酵母的 HB2 構建體(ti) ，可以很容易地移植到釀酒酵母中。他們(men) 為(wei) 我們(men) 的 iGEM 項目捐贈了 HBD2 構建體(ti) 樣品，節省了該團隊用於(yu) 合成的資源。

個(ge) 人評價(jia)

由於(yu) 時間限製，該團隊沒有將整個(ge) 光遺傳(chuan) 學回路轉移到 P. pastoris 中。值得我們(men) 學習(xi) 的地方是該團隊利用 HP 聯係了許多公司，獲得了贈送的 HBD2 構建體(ti) 樣品，節省用於(yu) 合成的資源，降低了項目推進的難度與(yu) 成本.

該團隊使用紅藍雙色光設計了雙激活-去激活的光遺傳(chuan) 學表達開關(guan) ，驅動菌體(ti) 自殺，可以借鑒。該團隊沒有詳細做商業(ye) 規劃、資金投入和收入預估等 Hp 項目，尤其對於(yu) 他們(men) 這種應用到農(nong) 業(ye) 生產(chan) （較易實驗）的商業(ye) 產(chan) 品，顯得項目沒有很好的收尾，是缺陷所在。