ELIXIO-國立圖盧茲應用科學學院2021年iGEM項目課題分享

XMU-iGEM 2024課題分享

1、課題標題

ELIXIO— Toulouse INSA-UPS

2、課題背景

香水在我們(men) 的日常生活十分常見。2020年全球香水市場價(jia) 值達到328億(yi) 美元，預計在接下來的幾年裏香水市場也將穩步增長。香料用於(yu) 香水，也用於(yu) 許多其他化妝品和衛生用品。但如今許多調香師和配方師通過化學手段來產(chan) 生這些香料分子，其生產(chan) 過程耗能且並不環保。所以該課題組想要通過合成生物學的方法來合成這些香料分子。

課題原理

該課題組開發了一個(ge) 模塊化的平台來產(chan) 生具有紫羅蘭(lan) 氣味的氣味分子。為(wei) 了采用可持續和環境友好的方法，我們(men) 設計了一個(ge) 由酵母(Saccharomyces cerevisiae)和分泌蔗糖的藍藻(Synechococcus elongatus UTEX 2973 CscB+)組成的合成微生物聯合體(ti) 。酵母經改造後可產(chan) 生具有花香的紫羅蘭(lan) 萜類化合物：α-離子酮、β-離子酮、二氫β-離子酮和芳樟醇；藍藻經工程改造後可以產(chan) 生紫羅蘭(lan) 葉醛：nona-2,6-二烯醛和nona-2,6-二烯醇。每個(ge) 分子的比例計劃由一個(ge) 調節係統來調節，以產(chan) 生這些氣味分子的定製混合物。

（一）生產(chan) 紫羅蘭(lan) 萜烯的工程釀酒酵母菌

該課題組需要在酵母中產(chan) 生四個(ge) 分子，最重要的是紫羅蘭(lan) 酮和芳樟醇。由於(yu) 這些分子不會(hui) 在釀酒酵母中自然產(chan) 生，該課題組往酵母菌中引入了相關(guan) 的酶來創造新的合成途徑。

圖1：在釀酒酵母中生產(chan) 紫羅蘭(lan) α-紫羅蘭(lan) 酮、β-紫羅蘭(lan) 酮、二氫-β-紫羅蘭(lan) 酮和芳樟醇萜烯內(nei) 源和外源通路

1. α-紫羅蘭(lan) 酮和β-紫羅蘭(lan) 酮

紫羅蘭(lan) 酮屬於(yu) C13 apocarotenoids。在某些植物中，番茄紅素分兩(liang) 步產(chan) 生紫羅蘭(lan) 酮。番茄紅素首先轉化為(wei) 胡蘿卜素，然後被類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(CCD)裂解，產(chan) 生兩(liang) 個(ge) 離子酮分子。α-紫羅蘭(lan) 酮由ε-胡蘿卜素裂解產(chan) 生，β-紫羅蘭(lan) 酮由β-胡蘿卜素裂解產(chan) 生。對於(yu) α-紫羅蘭(lan) 酮的生成，該課題組利用了來自 Latuca sativa的lycopene ε-cyclase(LcyE)將番茄紅素轉化為(wei) ε-胡蘿卜素，而對於(yu) β-紫羅蘭(lan) 酮的生產(chan) ，該課題組選擇了Pantoea ananatis中的lycopene β-cyclase (CrtY)將番茄紅素轉化為(wei) β-胡蘿卜素。

由於(yu) 涉及CCD酶的下一個(ge) 酶促步驟先前已被證明是限速步驟。為(wei) 了克服這一限製，對大腸杆菌中最高效的CCD進行了合理的酶工程改造。在這項工作中，從(cong) OfCCD1進行定點誘變，分離出催化性能更好的突變體(ti) ，但仍有很大比例的ε-胡蘿卜素和番茄紅素未被轉化，這可能是由於(yu) 細胞質OfCCD1酶難以接近其通常被困在膜內(nei) 的底物。為(wei) 了解決(jue) 這個(ge) 問題，將工程化的OfCCD1融合到膜結合的LcyE中。總的來說，這些修飾使大腸杆菌中的α-離子酮增強了>2.5倍。

2. 二氫-β-Ionones

β-紫羅蘭(lan) 酮在青蒿烯酸還原酶DBR1的催化下可以轉化為(wei) 二氫-β-紫羅蘭(lan) 酮。

3. 芳樟醇

芳樟醇是一種源於(yu) GPP的單萜類化合物(C10)。在芳樟醇合成酶(LIS)的作用下，GPP會(hui) 轉化成芳樟醇。該課題組選擇了來自Lavandula angustifolia的LIS基因。

4. 改進

由於(yu) 在α-紫羅蘭(lan) 酮中出現的問題也存在於(yu) β-紫羅蘭(lan) 酮中，該課題組選擇設計兩(liang) 種融合酶。首先，為(wei) 了在釀酒葡萄球菌中產(chan) 生α-紫羅蘭(lan) 酮，我們(men) 使用(GGGS)4linker將工程OfCCD1融合到LCYe的c末端，同樣的方法也應用於(yu) β-紫羅蘭(lan) 酮。在這種情況下，該課題組選擇了矮牽牛(PhCCD1)的CCD1，因為(wei) 它對β-胡蘿卜素具有更高的選擇性。

除了CrtY和PhCCD1之間的融合酶外，還針對β-ionone進行了另一種設計作為(wei) 備用方案。為(wei) 此，分離了CrtY和PhCCD1基因。為(wei) 了實現底物通道並增加PhCCD1對底物的可及性，這種酶在這種情況下使用fyn目的肽定位到膜上。除了單個(ge) 氨基酸突變(K164L)外，與(yu) 酵母中的天然酶相比，該策略已被證明可將β-離子酮的產(chan) 量提高4倍。

圖2，圖3，圖4：生物酶法合成 α-紫羅蘭(lan) 酮，β紫羅蘭(lan) 酮和紫羅蘭(lan) 的中心香料氣味的總括

（二）可持續生產(chan) 紫羅蘭(lan) 綠香味的工程藍藻

該課題組希望設計一個(ge) 合成微生物聯盟，由改造的生產(chan) 萜烯的酵母菌株和已經改造的分泌蔗糖的藍藻(S. elongatus)組成，後者為(wei) 酵母菌提供碳源。此外，為(wei) 了進一步完善生產(chan) 紫羅蘭(lan) 香的目標，該課題組進一步改造了藍藻，使其生產(chan) 紫羅蘭(lan) 葉醛。雖然這些分子在紫羅蘭(lan) 香中是次要的，但可以使其盡可能接近完美的紫羅蘭(lan) 香。

1. 蔗糖分泌，與(yu) 釀酒酵母共培養(yang) ：

已知許多藍藻能積累蔗糖以抵抗滲透脅迫。在iptg誘導啟動子PlacUV5的控製下，在藍藻UTEX 2973中引入了來自大腸杆菌的sucrose/H+ symporter CscB，其產(chan) 糖率為(wei) 1.9 g.L−1。

圖5：在 Syn UTEX 2973 中蔗糖分泌的途徑 （A）

在Syn UTEX 2973 中蔗糖分泌的代謝途徑（B）

但如果從(cong) 培養(yang) 基中回收糖，該方法既昂貴又低效，另故該課題組選擇在分泌蔗糖的藍藻和酵母菌間建立合成微生物聯盟。工程微生物群落在合成生物學應用方麵具有巨大的潛力。優(you) 勢包括增強穩健性，減少勞動分工帶來的代謝負擔，以及生物之間的資源交換和溝通。該課題組決(jue) 定在產(chan) 生萜烯的工程酵母菌株和分泌蔗糖的Syn UTEX 2973菌株之間建立共培養(yang) 。

藍藻產(chan) 生的蔗糖和氧氣被酵母利用，酵母在生長過程中產(chan) 生二氧化碳，為(wei) 藍藻模塊提供額外的碳源。這樣，兩(liang) 種生物以一種互惠互利的方式相互作用，使得二氧化碳為(wei) 基礎的紫羅蘭(lan) 香成分的可持續生產(chan) 。

圖6：ELIXIO，一種用於(yu) 生產(chan) 可持續紫羅蘭(lan) 香水合成微生物聯盟

2. 紫葉醛通過脂氧合酶途徑產(chan) 生

S. elongatus能夠在強光和CO2富集的條件下產(chan) 生不飽和脂肪酸，如亞(ya) 油酸或α-亞(ya) 麻酸(Silva et al. 2014)。這些分子是可以成為(wei) “紫羅蘭(lan) 葉醛”的前體(ti) :(2E,6Z)-非二烯醛和(2E,6Z)-非二烯醇。這些“綠葉醛”的產(chan) 生通過脂氧合酶途徑在植物中自然發生。在這一途徑中，脂肪酸被脂氧合酶(LOX)氧化形成相應的氫過氧化物，其會(hui) 在氫過氧化物裂解酶(HPL)生成所需的綠葉醛。

項目設計

1. pVIOLETTE：α-紫羅蘭(lan) 酮

α-紫羅蘭(lan) 酮是紫羅蘭(lan) 氣味的特征分子，該課題組將關(guan) 鍵的LcyE-OfCCD1融合，並使用強半乳糖誘導啟動子的對其的表達進行控製。

圖7：生產(chan) α-紫羅蘭(lan) 酮基因回路

2. pFRAMBOISE：β-紫羅蘭(lan) 酮

由於(yu) β-ionone也對紫羅蘭(lan) 氣味有重要貢獻，故該課題組使用PTetO7對其進行精細的調控，PTetO7由rtTA激活劑控製，響應多西環素的添加。

圖8、圖9：生產(chan) β-紫羅蘭(lan) 酮的基因回路

3. pFLEUR：芳樟醇和二氫-β-紫羅蘭(lan) 酮

該質粒中使用了兩(liang) 種誘導型的啟動子進行調控：DBR1表達受雌二醇誘導啟動子PZ3eV控製，芳樟醇合成酶表達受銅誘導啟動子PCUP1控製。

圖10：生產(chan) 芳樟醇和二氫-β-紫羅蘭(lan) 酮的基因回路

4. pCONCOMBRE：

該質粒的設計基於(yu) 質粒pAM4951。該質粒可以用於(yu) 將染色體(ti) 整合到藍細菌的中性位點I (NSI)中，這將產(chan) 生一個(ge) 具有中等拷貝數插入片段的穩定菌株。此外，該質粒骨架還包含一個(ge) 大腸杆菌pBR322複製起點以及一個(ge) 質粒轉移的接合起點。

圖11：可以用於(yu) 將染色體(ti) 整合到藍細菌的中性位點I (NSI)的基因回路

個(ge) 人評價(jia)

首先在選題上選擇了法國香水製造業(ye) 作為(wei) 選題背景，指出了現今香水製造的環境問題，在關(guan) 於(yu) 香水的環保製造上進行了課題設計，這使得該課題的設計具有較高的現實意義(yi) 與(yu) 經濟價(jia) 值。之後在課題設計上相對完整，運用到了兩(liang) 個(ge) 底盤生物，並采用共培養(yang) 的方式使得兩(liang) 種菌互惠互利，進而解決(jue) 以二氧化碳為(wei) 原料的香水製造。

同時，該課題組的對相關(guan) 的香水市場進行了調研，使其課題更具備了可行性。此外該課題組在進行人類實踐時，進行的調查與(yu) 采訪相對全麵，課題的每個(ge) 部分都與(yu) 人類實踐息息相關(guan) ，具有較高的現實價(jia) 值與(yu) 現實意義(yi) 。