SSR-中國農業大學2021年iGEM課題項目簡介

課題閱讀

XMU-China 2023

課題：

SSR: Saline-alkaline Soil Restorer

主要內(nei) 容：

利用穀氨棒狀杆菌合成γ-PGA 來改善鹽堿地

關(guan) 鍵詞：

鹽堿地、γ-聚穀氨酸、穀氨酸棒狀杆菌、土壤恢複

一、背景介紹

在中國，鹽堿地已經成為(wei) 一個(ge) 日益突出的問題。僅(jin) 看1998年的數據，我國鹽堿地麵積已達99萬(wan) 公頃，居世界第三位。同時，由於(yu) 過度耕作或缺乏保護，曾經正常的土壤也在逐漸變成鹽堿地。

圖1.中國的鹽堿地分布及類型

該團隊發現粘性聚合物γ-聚穀氨酸（γ-PGA）可以通過解離產(chan) 生氫離子，因此可以中和堿並吸收土壤膠體(ti) 中的可交換鈉離子，從(cong) 而恢複土壤。此外，它還可以形成soil aggregate（良好的土壤結構），提高土壤的持水能力，有利於(yu) 植物的根係。因此，該團隊認為(wei) γ-PGA正是需要為(wei) 這個(ge) 項目找到的目標產(chan) 品。

有兩(liang) 種細菌與(yu) γ-PGA有關(guan) ：枯草芽孢杆菌，如果喂食原料穀氨酸，它們(men) 可以合成γ-PGA。和穀氨酸棒狀杆菌，它本身可以高產(chan) 合成穀氨酸。

最初，該團隊希望設計一個(ge) 共生係統，其中穀氨酸棒狀杆菌可以提供穀氨酸，枯草芽孢杆菌可以產(chan) 生γ-PGA。然而，在與(yu) 專(zhuan) 家的進一步討論中，得知這兩(liang) 種細菌在土壤中並不清楚是否為(wei) 互利共生關(guan) 係。因此，最終選擇了穀氨酸棒狀杆菌作為(wei) 底盤，旨在通過工程單獨合成γ-PGA。

二、實驗設計

通過對課題整個(ge) 設計邏輯的逐步了解，該課題的設計思路便十分容易理解，首先既然要賦予穀氨酸棒狀杆菌獨特的功能，那就應該導入產(chan) 生γ-PGA的基因，然後確保整個(ge) 通路連貫使得其最終能夠產(chan) 生γ-PGA，其中該課題組便增加了一步：修改穀氨酸棒狀杆菌的TCA循環，使得更多的穀氨酸用於(yu) γ-PGA合成，最後便是保證生物安全，防泄露。

第一步，驗證所選啟動子的強度。在此，該團隊選擇了一種較為(wei) 獨特的組成型啟動子（P0864（BBa_K3796000）），由於(yu) 在注冊(ce) 表中幾乎沒有信息，因此該團隊打算先來測試其強度。下圖為(wei) 設計的檢測啟動子強度的基因回路。由於(yu) 是組成型啟動子，因此需要外加一個(ge) Ptac啟動子來控製起始，而空白組則是用來排除Ptac啟動子泄露表達的影響。該實驗在穀氨酸棒狀杆菌和大腸杆菌中皆進行了實驗。

圖2.檢測P0864強度的遺傳(chuan) 回路

圖3.空白對照的遺傳(chuan) 回路

實驗結果分別呈現了定量和定性結果，並可以看出P0864是一種組成型強啟動子，同時在穀氨酸棒狀杆菌和大腸杆菌皆有效。但是在穀氨酸棒狀杆菌中強度更大。

圖4.定性觀察大腸杆菌和穀氨酸棒狀杆菌表達的熒光蛋白的差異

a.離心後穀氨酸棒狀杆菌的圖像，實驗組（左）和對照組（右）。

b.離心後大腸杆菌的圖像，實驗組（左）和對照組（右）。

圖5.大腸杆菌和穀氨酸梭菌在37°C培養(yang) 26小時後，測定熒光強度數據與(yu) OD600數據的比值

（580nm的激發光和610nm的發射光）

第二部分，進行合成γ-PGA的基因導入。

圖6.需要構建模塊

其中，合成γ-PGA相關(guan) 基因已經較為(wei) 明晰，其中涉及capA、capB和 capC三個(ge) 蛋白的相關(guan) 基因。然而可惜的是，由於(yu) 模塊長度較大，沒能將三個(ge) 片段整合在一起。

第三部分，增強工程菌用穀氨酸合成γ-PGA的代謝途徑。

為(wei) 了改善由檸檬酸循環中間體(ti) α-酮戊二酸形成的穀氨酸的產(chan) 生，該團隊決(jue) 定衰減編碼KGDH的odhA，催化α-KG形成琥珀酰輔酶A形成，從(cong) 而將更多的碳通量引入穀氨酸合成而不是琥珀酰輔酶A形成。因此，該團隊設計了將較弱強度的RBS引入其ORF上遊以進行odhA衰減的實驗。這涉及了對其基因組進行修飾。

圖7. C. glutamicum基因組ppc上遊RBS修飾序列

該團隊成功構建了重組質粒，並且使用電穿孔的方法將其轉化進入穀氨酸棒狀杆菌中，但是在最終抗性篩選過程中，沒能發現最終的重組型細菌。

第四步，這也是為(wei) 什麽(me) 我重點閱讀該課題，自殺開關(guan) 。

由於(yu) 該課題的著眼環境是鹽堿土地，因此該團隊希望當工程菌感知到鹽堿度下降或PH改變時便啟動自殺開關(guan) ，其中涉及鹽堿度感知啟動子、PH感知啟動子、毒性蛋白三部分。該團隊驗證的方法也十分有邏輯性，用綠色熒光蛋白分別驗證兩(liang) 種啟動子的敏感性，然後驗證蛋白毒性，最後合在一起來測試效果。

圖8.用於(yu) PgsiB（鹽濃度感知）驗證的基因回路

圖9. 用於(yu) Patp2（PH應激）驗證的基因回路

圖10. 用於(yu) ndoA（毒性蛋白）驗證的遺傳(chuan) 回路

分開測定，鹽濃度感知、PH應激都能產(chan) 生不同的綠色熒光蛋白的表達，同時毒性蛋白也能在一定濃度下起到殺傷(shang) 作用。也就說results部分有著符合預期的結果。但是同樣可惜的是，該團隊並沒有完成最終的複合開關(guan) 的檢驗。

三、實現形式：

考慮到成本的問題，該團隊選擇使用直接的菌劑產(chan) 品進行播撒，並不選擇將其進行包封或其它處理。目標用戶包括土壤修複行業(ye) 、林業(ye) 、農(nong) 業(ye) 、個(ge) 體(ti) 農(nong) 民，甚至任何想要種點東(dong) 西的人。細菌製劑有四種形式，包括凍幹粉、粉劑、顆粒劑和液體(ti) 劑，該團隊考慮到在不同的條件下使用它們(men) 。

如果用戶能負擔得起高昂的價(jia) 格，可以選擇凍幹粉狀菌劑，這種菌劑易於(yu) 儲(chu) 存，容易滲入土壤。使用時，需要提前將藥劑與(yu) 特殊液體(ti) 混合。如使用條件為(wei) 溫室或其他無風多塵的地方，用戶可通過孔洞或挖溝使用粉狀菌劑。粉末的最大優(you) 點是儲(chu) 存時間長，易於(yu) 運輸。如果用戶需要藥劑既要長期儲(chu) 存，又適合多風多塵的地區，可以通過發掘填埋的辦法使用顆粒劑。如果用戶想要使用少量的產(chan) 品同時想達到最佳效果，他們(men) 可以通過噴灌或滴灌來嚐試液體(ti) 細菌劑。但要注意，買(mai) 了要馬上用，因為(wei) 液體(ti) 劑不能長時間儲(chu) 存。

四、個(ge) 人觀點：

通過對其設計及使用思路的梳理，細致地了解到每個(ge) 實驗操作所要驗證的部分。先單獨針對每個(ge) part的有效性進行驗證，可以避免前麵的不起作用而影響接下來的實驗，同時即使出現失敗，整個(ge) 課題的設計脈絡也是清晰的。但是可惜的是，該課題受到疫情的影響，多數實驗僅(jin) 停留在results部分，最終的POC部分都沒有進行檢驗，而且在諸如獲得改變代謝特征的菌株這一單獨的實驗中，也沒能獲得預期的結果。最後，由於(yu) 是在土壤中的應用，其最終的實現形式可以借鑒。自殺開關(guan) 由於(yu) 其課題特性，無法利用到我們(men) 自己的課題中。

五、整體(ti) 思路補充：

穀氨酸棒狀杆菌本身能夠產(chan) 生穀氨酸，希望導入外源基因，這些基因所表達的蛋白能夠協助γ-PGA（γ-聚穀氨酸）產(chan) 生，然後確保整個(ge) 通路連貫使得其最終能夠產(chan) 生γ-PGA。

第一部分，驗證所選啟動子的強度（因為(wei) 本次選擇了較為(wei) 特殊的啟動子）

第二部分，進行合成γ-PGA的基因導入

第三部分，增強工程菌用穀氨酸合成γ-PGA的代謝途徑

第四部分，自殺開關(guan) 的設計與(yu) 驗證。在這一部分的驗證中同樣進行了分步驗證，最後整體(ti) 驗證。（雖然整體(ti) 驗證沒成功）