文獻分享：CRISPR/Cas9:一種消除野生大腸杆菌Nissle 1917中兩個隱性質粒的方法

文獻標題：

Development of Escherichia coli Nissle 1917 derivative by CRISPR/Cas9 and application for gamma-aminobutyric acid (GABA) production in antibiotic-free system

網址：

https://doi.org/10.1016/j.bej.2021.107952

關(guan) 鍵詞：

Escherichia coli Nissle 1917; Cryptic plasmid; CRISPR/Cas9; Gamma-aminobutyric acid; GABA; Antibiotic-free

主要內(nei) 容：

一、前言

EcN 作為(wei) 一種對腸道有益、不致病的大腸杆菌，有很廣泛的應用前景。然而，研究發現，野生型 EcN 體(ti) 內(nei) 含兩(liang) 種高度穩定的隱性質粒，即 pMUT1（NCBI號MW240712，3.2kb）和 pMUT2（NCBI號CP023342，5.6kb）。由於(yu) 這兩(liang) 種質粒的存在，導致其作為(wei) 工程菌的潛力受到限製。不僅(jin) 異源基因表達受限製，蛋白質表達的效果也不佳，而因為(wei) 質粒不相容的原因，外源質粒也很難能夠轉入其中並成功表達。

另一個(ge) 研究團隊發現，利用 CRISPR/Cas 9 技術消除EcN中一個(ge) 隱性質粒，能夠使得外源蛋白的表達強度有所提升，因此，本研究團隊打算利用 CRISPR/Cas9 技術消除 pMUT1 和 pMUT2，得到不含質粒的 EcN 衍生菌株 EcNP。

CRISPR/Cas9 是一種基於(yu) 細菌對入侵者的防禦機製的基因組編輯工具，由於(yu) 其高度準確的 DNA 目標定位特性和成熟的分子工具，已被廣泛應用。其中，sgRNA 序列是 CRISPR/Cas9 係統中的關(guan) 鍵因素，使 Cas9 酶能夠識別和切割目標 DNA。雙sgRNA 設計為(wei) Cas9 提供了兩(liang) 個(ge) 獨特的染色體(ti) 基因缺失靶點，同時也降低了細胞內(nei) 的 SOS 反應，從(cong) 而提高了基因編輯能力和效率。

*備注：質粒固化（plasmid curing）是指消除細菌中質粒編碼的功能，如抗生素抗性、毒力、芳香化合物的降解等的過程。文獻中已經報道了幾種質粒固化劑，然而，沒有一種質粒固化劑能夠消除不同宿主的所有質粒。在質粒穩定或性質損失難以確定的情況下，可以用固化劑處理細菌。這些包括化學和物理試劑，其中一些可以使 DNA 發生突變，特別幹擾其複製，或影響細菌細胞的特定結構成分或酶。

圖1：pMUT1 和 pMUT2 的圖譜

二、研究思路

研究者們(men) 首先發現消除一個(ge) pMUT1 或 pMUT2 可以提高異源基因和蛋白的表達，因此為(wei) 進行比對，他們(men) 在本項研究中先構建了如下的突變體(ti) 。

圖2：本項研究中構建的基礎突變體(ti) 菌株

為(wei) 了實現質粒的消除，他們(men) 在 pCas9-KT 的基礎上插入了不同的 sgRNA。這是針對每一個(ge) 隱質粒設計了一對 sgRNA 序列，其目的是為(wei) 了將質粒切割成兩(liang) 段，使其難以再次愈合，從(cong) 而達到質粒消除的作用。

另外，為(wei) 了研究 EcN 和 EcNP 菌株中異源基因的表達情況，他們(men) 又在兩(liang) 種菌株中以不同強度的J係列啟動子進行測試。接下來，他們(men) 還開發了以 pMUT1 和 pMUT2 為(wei) 基礎的新載體(ti) ，即 pMT1 和 pMT2，並對其穩定性進行研究，考察其作為(wei) 一個(ge) 載體(ti) 的可能性。最後他們(men) 利用 pMT1 和 pMT2，在EcNP中嚐試表達 gadB 基因，成功合成了γ-氨基丁酸 (Gamma-aminobutyric acid，GABA)。

本次閱讀主要著重於(yu) 學習(xi) 如何利用 CRISPR/Cas9 消除 EcN 的兩(liang) 個(ge) 質粒，以及其相關(guan) 的驗證等一係列操作。

三、材料與(yu) 方法

為(wei) 了消除 pMUT1 和 pMUT2，他們(men) 構建了一個(ge) pCas9-KT 質粒，並針對不同的用處做出了不同的改變，產(chan) 生三個(ge) 衍生物。

圖3：pCas9-KT 的衍生質粒

*備注：Km- kanamycin 卡那黴素

sgRNA：small guide RNA 小向導RNA

ori101/repA101ts：一個(ge) 對溫度敏感的複製原點（在37℃下丟(diu) 失）

載體(ti) 質粒消除係統的方法如下：

1.首先構建一個(ge) 含 Cas9 片段、溫度敏感起點（ori101/repA101ts）、Km 抗性的 pCas9-KT 質粒。

2.設計 sgRNA 片段，這個(ge) sgRNA 片段兩(liang) 側(ce) 含兩(liang) 個(ge) BsaI 酶切位點。sgRNA 的設計是針對不同目標質粒（pMUT1 或 pMUT2）來修改的。

圖4：三種 sgRNA 的設計

3. 通過在 Bsa I 位點酶切和酶連，將這些合成的 sgRNA 序列克隆到 pCas9-KT 中，以生成三個(ge) 質粒 pCK-sgM12、pCK-sgM1 和 pCK-sgM2。

4. 構建好質粒後，將質粒通過化學轉化，轉入 EcN 中，以無抗 LB 平板塗板，培養(yang) 過夜。

5. 進行菌落 PCR，隨後以 1.8 % 的瓊脂糖凝膠驗證 PCR 產(chan) 物。

圖5：pCas9-KT 與(yu) 其三個(ge) 衍生質粒的構建情況

四、結果

菌落PCR跑膠情況如下圖所示。

圖6

其中，M 為(wei) 10kb 的 marker，泳道1為(wei) 野生EcN PCR結果；泳道為(wei) 轉入 pCas9-KT 的 EcN；泳道 3為(wei) EcNP（即去除了 pMUT1 和 pMUT2）；泳道 4為(wei) EcNP1（去除了 pMUT2）；泳道 5為(wei) EcNP2（pMUT1 已移除）。箭頭表示 pMUT1 和 pMUT2 質粒。

DNA 電泳結果表明，利用研究者們(men) 設計的方法，EcN 中的兩(liang) 個(ge) 隱性質粒均被去除形成了 EcNP，而 EcNP1 和 EcNP2 中分別僅(jin) 存在 pMUT1 和 pMUT2。這種方法可以同時消除兩(liang) 種隱性質粒，效率高，時間短（小於(yu) 7天）。

此外，研究者們(men) 將不同的J 係列啟動子連接 sfGFP 熒光蛋白基因後，導入 EcN 和 EcNP 中表達（J 係列啟動子的強度順序為(wei) J23100 > J23105 > J23114 > J23109），其強度結果測試與(yu) DH5α 中的測試結果一致，且結果表明 EcNP 中 J 係列啟動子的表達普遍比 EcN 更強。為(wei) 了進一步確認質粒的拷貝數（plasmid copy number, PCN）是否影響異源基因的表達情況，將具有不同複製起點的最常見質粒（即pUC、pMB1 和p15A）轉化為(wei) EcN 和EcNP 以進行比較。結果表明，EcNP 中的 PCN 高於(yu) EcN 和其他大腸杆菌。

總結來說，一係列測試表明，消除了兩(liang) 個(ge) 隱性質粒 pMUT1 和 pMUT2 的 EcNP 在異源基因的表達上有更大的優(you) 勢。

個(ge) 人評價(jia) ：

從(cong) 本篇文獻中學習(xi) 了利用 CRISPR/Cas9 消除 E. coli Nissle 1917 的方法，找到了外源質粒無法轉入 E .coli Nissle 1917 的解決(jue) 辦法。後續將以本篇文獻為(wei) 根據，並在師兄指導下完成 E .coli Nissle 1917 的改造，方便後續的其他操作。