文獻分享—— Quorum-Quenching Human Designer Cells for Closed-Loop

文獻分享

Quorum-Quenching Human Designer Cells for Closed-Loop Control

of Pseudomonas aeruginosa Biofilms

介紹

Introduction

越來越多的細菌被發現對抗生素產(chan) 生了耐藥性。其中，革蘭(lan) 氏陰性菌銅綠假單胞菌引起的傷(shang) 口和肺部感染仍然是臨(lin) 床上的主要問題。銅綠假單胞菌的耐藥性增強是因為(wei) 生物膜的形成，以及由群體(ti) 感應現象協調的大量微生物毒力因子的產(chan) 生。因此，控製細菌群體(ti) 感應，幹擾生物膜的完整性是抑製銅綠假單胞菌耐藥性的可行思路。合成生物學為(wei) 實現該思路提供了以編程工程細胞為(wei) 主的一係列技術手段。該團隊以誘導群體(ti) 淬滅關(guan) 閉群體(ti) 感應同時破壞菌體(ti) 生物膜為(wei) 目的設計了針對銅綠假單胞菌耐藥性的工程細胞，同時對傳(chuan) 感器傳(chuan) 感效果、生物膜水解等重點功能進行了詳盡的實驗驗證。

設計構想

Design

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工程細胞的設計試想：關(guan) 閉群體(ti) 感應，產(chan) 生群體(ti) 淬滅，能夠檢測和對抗病原體(ti) 。因此需要一種傳(chuan) 感器來感應來自銅綠假單胞菌的自誘導物，也就是需要向細胞中導入非真核宿主固有的細菌通訊信號。銅綠假單胞菌主要通過兩(liang) 種信號分子高絲(si) 氨酸內(nei) 酯（HSL）實現群體(ti) 感應。細胞通透性假單胞菌自誘導因子1(PAI-1，3O-C₁₂-HSL)幫助逃避免疫係統，調節促炎途徑;自誘導因子PAI-2(C₄-HSL)調控生物膜形成。因此以這兩(liang) 種HSL入手。轉錄激活因子LasR依賴於(yu) PAI-1開啟活性，可用於(yu) 構建輸入模塊。

群體(ti) 淬滅係統

Design

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圖1. 群體(ti) 淬滅係統的設計和原理。

感應&輸入模塊：假單胞菌自誘導傳(chuan) 感器(Pseudomonas Autoinducer Sensor)PAiS是一個(ge) 結構性表達的融合蛋白，包括來自單純皰疹病毒的VP16反式激活域，以及核定位信號(NLS)和轉錄調節因子LasR（感應PAI-1）。該模塊使HEK-293細胞能夠監測銅綠假單胞菌產(chan) 生的自誘導劑PAI-1(3O-C₁₂-HSL)的水平。

異位表達的PAiS在被PAI-1激活後，能夠與(yu) 合成的P_PA1啟動子結合，該啟動子具有啟動子P_hCMVmin上遊的LasR特異操縱子位點，用來啟動能夠破壞生物膜的糖苷水解酶(PslG_h和PelA_h)和自誘導失活內(nei) 酯酶(MomL)的表達。

PAiS傳(chuan) 感效果驗證

Experiment

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圖2. PAiS對自誘導物的傳(chuan) 感效果驗證。

A.將PAiS (VP16-NLS-LasR)表達載體(ti) 和與(yu) 啟動子P_PA1組裝在一起的SEAP(人胎盤分泌型堿性磷酸酶；P_PA1-SEAP-pA)或熒光胞漿蛋白TurboGFP(P_PA1-TurboGFP-pA)一並轉染HEK-293細胞。這裏SEAP或TurboGFP作為(wei) 報告基因發揮作用。PAI-1結合並激活PAiS，與(yu) P_PA1啟動子結合，啟動SEAP或TurboGFP的表達。該線路用來證明PAiS對PAI-1的傳(chuan) 感作用。

B.從(cong) 傳(chuan) 感係統的不同組合方式種挑選出最優(you) 組合。圖中pSF144為(wei) 報告基因（SEAP），pFS165是結構性表達啟動子P_SV40與(yu) PAiS（VP16-NLS-LasR）的組合，pFS158是P_hEF1α與(yu) PAiS的組合,pFS145是P_hEF1α與(yu) LasR-NLS-VP16的組合，pCK25則是P_hEF1α-URS-pA。以上表達載體(ti) 轉染HEK-293細胞，培養(yang) 24h後檢測SEAP的表達。結果顯示，pFS165和pFS158在10μM PAI-1存在下都表現出較高的表達水平。而pFS145沒有，原因是VP16反式激活結構域的羧基末端融合導致融合蛋白失去了感應PAI-1的能力。

C.PAiS_SEAP共轉染(pFS165/pFS144)HEK-293細胞在不同PAI-1水平的培養(yang) 液中培養(yang) 24小時，然後檢測SEAP水平。結果顯示PAiS_SEAP工程(pFS165/pFS144)HEK-293細胞對銅綠假單胞菌自誘導因子PAI-1具有微摩爾敏感性(EC₅₀=1μM)，該濃度與(yu) 銅綠假單胞菌分離株釋放的水平相等。

D.將P_hEF1α-PAiS和P_PA1-SEAP轉染不同的細胞株，PAI-1誘導24h後檢測SEAP的表達。結果顯示在HEK-193細胞中的效果最好。

E.培養(yang) PAiS_SEAP41₍₁₎HEK-293單克隆細胞群72 h，每24 h改變PAI-1水平(5μM)，顯示PAiS係統中SEAP表達的可逆性。結果表明，該線路的激活是完全可逆的，而且可以通過添加和除去PAI-1來反複打開和關(guan) 閉傳(chuan) 感器。

F.PAiS對自誘導劑具有特異性，僅(jin) 對銅綠假單胞菌產(chan) 生的3O-C₁₂-HSL和紫色色杆菌產(chan) 生的C₁₂-HSL響應。

G.實時監測PAI-1觸發的PAiS_tGFP工程(pFS165/pFS160)細胞群的熒光，證實了PAiS對PAI-1具有高敏感性。

H.PAiS_tGFP工程細胞群暴露在PAI-1環境中不同時間產(chan) 生的熒光強度，在熒光顯微鏡下觀察。結果顯示PAiS工程細胞在與(yu) PAI-1接觸3小時即產(chan) 生了熒光。

群體(ti) 淬滅內(nei) 酯酶的篩選

Experiment

下一步，通過將PAiS模塊與(yu) 群體(ti) 感應自誘導劑滅活酶的表達聯係起來，從(cong) 而達到控製群體(ti) 感應信號的積累的作用。通過以下實驗從(cong) 來自細菌和人的候選酶中選出最優(you) 酶。

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圖3. 群體(ti) 淬滅內(nei) 酯酶的篩選和驗證。

A.群體(ti) 淬滅內(nei) 酯酶的篩選實驗設計。將表達候選內(nei) 酯酶的細胞用相同濃度的PAI-1處理30min，然後將上清液轉移到PAiS_SEAP細胞上，來檢測上清液中PAI-1的剩餘(yu) 濃度，從(cong) 而選擇降解效果最好的酶。

B.以上實驗的結果。其中優(you) 化後的內(nei) 酯酶MomL的催化效果是最好的，表現出最低的SEAP水平，說明剩餘(yu) 的PAI-1最少。

C.同樣的實驗將PAI-1替換成PAI-2(C₄ HSL)，MomL同樣表現出最好的催化效果。

D.實驗方法應同A。用不同濃度的PAI-1處理PAiS_MomL工程細胞，上清液加入PAiS_SEAP工程細胞，通過SEAP的濃度反應溶液中剩餘(yu) 的PAI-1水平，從(cong) 而檢驗PAiS_MomL的PAI-1依賴性，檢驗閉環的形成。

E.PAiS_MomL的PAI-1依賴性。圖片顯示MomL的水平隨PAI-1濃度的變化，結果顯示PAI-1足以觸發高劑量的MomL分泌（EC₅₀ = 0.7μM）。

F.測試PAiS對銅綠假單胞菌釋放的群體(ti) 感應信號分子的感知和響應能力。觀察到PAiS能夠感知並響應銅綠假單胞菌釋放的群體(ti) 感應信號分子，體(ti) 現在SEAP的水平高於(yu) 對照組。對照組所用LasI^-為(wei) 缺陷型，不表達HSL。

G.PAiS_MomL工程細胞與(yu) 銅綠假單胞菌的共培養(yang) 模型。將PAiS_MomL工程細胞培養(yang) 在可穿透性細胞培養(yang) 小室的上層。下層是銅綠假單胞菌和肺上皮細胞。

H.圖G的結果。通過檢測培養(yang) 液中的LDH，反映肺上皮細胞受銅綠假單胞菌的殺傷(shang) 作用。結果顯示，PAiS_MomL工程細胞通過對自誘導物的降解將假單胞菌對肺上皮細胞的殺傷(shang) 率降低了35%。幾乎與(yu) 對照組（結構性表達MomL的工程細胞）齊平。

生物膜水解驗證

Experiment

針對頑固生物膜的合成群體(ti) 淬滅級聯反應的第二階段。利用了銅綠假單胞菌外質糖苷水解酶PslG/PelA，從(cong) 這兩(liang) 種酶中選擇了催化糖苷水解酶結構域，並對它們(men) 進行了微調，以便在哺乳動物細胞中高效表達、分泌和穩定。

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圖4. 銅綠假單胞菌生物膜的水解。

A.通過糖苷水解酶和內(nei) 酯酶的聯合作用預防銅綠假單胞菌生物被膜。構建能分泌MomL(P_hCMV-SS_Igκ-Fc_mIg-MomL-pA，pFS218)、PslG_h(P_hCMV-SS_Igκ-Fc_mIg-PslG_h-pA，pTJ02)和/和PelA_h(P_hCMV-SS_Igκ-Fc_mIg-PelA_h-pA，pTJ01) 的HEK-293細胞，48h後將上清液(50%v/v)與(yu) 銅綠假單胞菌混合。孵育24 h後，檢測生物膜的形成。結果顯示，在MomL,PslG和PelA的共同作用下，兩(liang) 種銅綠假單胞菌的生物膜都被削弱了。

B.對已經形成的銅綠假單胞菌生物膜的處理。用培養(yang) 48h的工程細胞的上清液對預製的銅綠假單胞菌生物膜處理30min，用結晶紫對剩餘(yu) 生物膜進行定量。結果顯示基本在30min內(nei) 就分散了已經形成的生物膜。

C.群體(ti) 淬滅工程細胞控製生物膜的形成實驗示意圖。在驗證了三個(ge) 模塊的抗感染效果後，MomL、PslG_h和PelA_h被置於(yu) PAiS模塊的控製下，從(cong) 而最終完成了群體(ti) 淬滅線路的設計。將導入該線路的工程菌培養(yang) 在可穿透性細胞培養(yang) 小室的上層，下層是銅綠假單胞菌。用來檢測工程菌對生物膜形成的作用。

D.上述實驗的結果。培養(yang) 24h後，結果顯示該工程細胞能夠使銅綠假單胞菌生物膜的量減少一半。

抗生素耐藥性抑製驗證

Experiment

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圖5. 群體(ti) 淬滅工程菌增強抗生素對生物膜的控製效果。

A.構建分泌MomL(P_hCMV-SS_Igκ-Fc_mIg-MomL-pA，pFS218)、PslG_h(P_hCMV-SS_Igκ-Fc_mIg-PslG_h-pA，pTJ02)和PelA_h(P_hCMV-SS_Igκ-Fc_mIg-PelA_h-pA，pTJ01)的HEK-293細胞，培養(yang) 48h後，上清液與(yu) 銅綠假單胞菌PA01混合培養(yang) 24 h。用不同濃度的妥布黴素處理後檢測生物膜的形成。結果顯示，2μg/mL妥布黴素對銅綠假單胞菌的殺傷(shang) 力，工程細胞組是對照組(pEGFP-N1)細胞的9倍。