文獻分享 Biomolecules：鹽的添加增強AFPs的IRI活性

文獻標題：

The Impact of Salts on the Ice Recrystallization Inhibition Activity of Antifreeze (Glyco) Proteins

網址：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31390745/

關(guan) 鍵詞：

鹽溶液; IRI; AF(G)P

概述：

本文獻旨在說明在培養(yang) 和低溫保存介質中鹽的添加會(hui) 增強AFPs的IRI活性。實驗發現，在AFGP1-5和含有氯離子、磷酸根離子和檸檬酸根離子的III型AFP樣品中，培養(yang) 90分鍾後，生長的冰晶體(ti) 的尺寸在統計學上小於(yu) 沒有添加這些鹽的情況下生長的晶體(ti) 。在固定的整體(ti) 離子強度為(wei) 100mM時製備的AFGP1-5和III型AFP樣品的冰再結晶率（kd）按照陰離子的Hofmeister係列逐步下降。因此結果表明，AF(G)Ps的性能受到普通低溫保存介質中的添加劑的顯著影響。

主要內(nei) 容：

一、實驗背景：

在19世紀末，Franz Hofmeister觀察並量化了加入含有相同陽離子的不同鹽類所引發的蛋白沉澱，Hofmeister的原始工作指出了蛋白質沉澱的離子特異性，其中陰離子比陽離子有更明顯的影響。雖然鹽類對TH的增強是有據可查的，但它們(men) 在冰的再結晶抑製（IRI）活動中的作用仍未解決(jue) 。因此，本文獻即解決(jue) 鹽類的添加對AF(G)P的再結晶抑製（IRI）的影響。

二、冰再結晶抑製（IRI）試驗——蔗糖夾心法：

研究IRI活性的經典定量方法，如split試驗和毛細管法，對檢測IRI的微小差異不夠敏感。液體(ti) 體(ti) 積分數太低，冰體(ti) 積分數太高，無法可靠地避免假陽性。  

IRI實驗是在5 nM（AFGP1-5）和500 nM（rQAE）的固定濃度下進行。實驗通過將2µL樣品夾在兩(liang) 塊蓋板之間來製備，在連接到尼康ECLIPSE Ci-Pol光學顯微鏡的Linkam LTS420平台上快速冷凍（20℃/分鍾）至-40℃（圖1）。然後將樣品在-7℃下退火90分鍾，同時每2分鍾拍攝一次顯微照片，以跟蹤冰的生長情況。

a

b

圖1：a: 0%的蔗糖溶液在-7℃退火50分鍾後的顯微照片（左）用ImageJ（右）轉換成二進製圖像，以確定樣品中冰晶的半徑。

b: 冰晶的立方數平均半徑隨時間線性增加，其斜率給出了生長速度常數。

三、實驗結果

選擇了兩(liang) 種廣泛研究的魚類防凍蛋白，它們(men) 在30wt%的蔗糖溶液中的IRI活性有三個(ge) 數量級的差異。

1、鹽對不含AF(G)Ps的30wt%蔗糖溶液中冰晶的尺寸和生長速率的影響。

經過90分鍾的退火時間，Shapiro-Wilk測試確定了所有不含蛋白質的鹽溶液中冰晶半徑的對數正態分布，大小在0.8和14.4微米之間（圖2）。磷酸鈉的數量平均半徑最小（=8.0 µm），硝酸鈉最大（=8.4 µm）。同樣，冰的再結晶率（kd = ∂3/∂t），磷酸鈉最小（kd = 7.1 µm3 min^-1），硝酸鈉最大（kd = 7.9 µm3 min^-1）。

且所有這五種陰離子使冰的再結晶率大約增加了30%，從(cong) 未加鹽的約5.5 µm3 min^-1增加到加鹽的30 wt%蔗糖溶液的7.5 ± 0.3 µm3 min^-1（圖3b）。

圖2：不含蛋白質的鹽溶液中冰晶半徑的對數正態分布

圖3：b&c

2、鹽對AFGP1-5的IRI活性的影響。

由於(yu) AFGPs是強效的冰再結晶抑製劑，在含有AFGP1-5的鹽漬蔗糖溶液中，冰晶的<R>仍然相當小（在1.4和6.3 µm之間）（圖4a），除了硼酸鈉（<R>~6.9 µm），所有鹽都是如此。根據LSW理論，觀察到所有5 nM AFGP1-5樣品的<R>3隨時間的變化呈線性增長（圖5a）。

鈉鹽極大地影響了AFGP1-5抑製冰再結晶的效力，因為(wei) 在固定的AFGP1-5濃度下，鹽漬蔗糖溶液的kd與(yu) φ0有很大的不同。

圖4：a&b

圖5：a

綜上描述，該文獻介紹了Hofmeister的陰離子係列對AFP的IRI能力的影響，所有的鹽都增強了rQAE和AFGP1-5的IRI活性，硝酸鈉的作用最弱，檸檬酸鈉的作用最強。令人驚訝的是，盡管硼酸鈉與(yu) AFGP1-5的羥基官能團發生反應，但仍保留了AFGP1-5的IRI活性，但是會(hui) 削弱TH活性。鹽的存在明顯影響了AF(G)Ps的性能，它們(men) 可能被用作低溫保存介質的添加劑，以抑製冰的再結晶，從(cong) 而減輕低溫損傷(shang) 。

個(ge) 人評價(jia) ：

該文獻所得出的結論，鹽的存在明顯影響了AF(G)Ps的性能，這個(ge) 結果有助於(yu) 更好地理解輔料（特別是鹽）對低溫保存配方性能的不同影響所依據的物理機製。同時，對於(yu) 我們(men) 的課題也有很大的幫助，在後續AFP產(chan) 品的加工過程中給，我們(men) 是否可以通過添加相關(guan) 鹽類物質來提高其抗凍能力，從(cong) 而發揮更好的效果，並且，該文獻提出一個(ge) 新的檢驗IRI的實驗方法，蔗糖夾心法，為(wei) 我們(men) 的IRI的protocal提供了新的思路。