IGEM文獻分享 Cell Reports: 一種適用於環境分離的耐藥性菌株的基因編輯技術

文獻標題：Native CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing Enables Dissecting and Sensitizing Clinical Multidrug-Resistant P. aeruginosa

DOI號：10.1016/j.celrep.2019.10.006

關(guan) 鍵詞：銅綠假單胞菌；耐藥性；CRISPR-Cas

摘要：

利用銅綠假單胞菌的內(nei) 源I-F型CRISPR-Cas係統，建立的一種適用於(yu) 其臨(lin) 床/環境分離的耐藥性菌株的高效且原位的基因編輯技術

1.背景

AMR：Antimicrobial resistance，耐藥性

MDR：multidrug-resistant，多重耐藥性

銅綠假單胞菌是一種分布範圍廣的典型的多重耐藥性病原菌，它本身就能抵抗很多種藥物，並且它從(cong) 外界獲得耐藥性的能力也很強。銅綠假單胞菌的基因組很大（6.4 Mbp)並且多變，因此，用在典型銅綠假單胞菌上的基因編輯係統對臨(lin) 床/環境分離出的具有多重耐藥性的銅綠假單胞菌不太適用。並且，常常有成簇的抗藥性標誌性序列（marker）出現在臨(lin) 床的MDR菌株的基因組和可移動元件上，這些marker被發現對細菌的抗藥性水平具有重要的影響，於(yu) 是，靶向這些maeker是很有效且必要的。

研究表明，在AMR 銅綠假單胞菌中，有70%具有I-F型CRISPR係統。之前也有用細菌的內(nei) 源性CRISPR係統來原位編輯致病菌的成功案例，於(yu) 是作者也嚐試用這個(ge) 辦法來對MDR銅綠假單胞菌編輯。

研究對象：

一種MDR銅綠假單胞菌，PA154197

PA154197性質特點：

i.與(yu) 另一種高危細菌ST175有類似的抗性

ii.有native I-F CRISPR-Cas Locus

以下展示研究結果。

2. 對PA154197內(nei) 源性CRISPR係統進行功能性分析

PA154197具有典型的I-F完整係統：完整的Cas蛋白和array（P.S.它的不同的repeat之間隻有一個(ge) 堿基的差異；spacer幾乎都是32bp，並且很多是噬菌體(ti) 的同源序列）。

Target gene：mexB基因，編碼內(nei) 膜組分，是一種AMR基因

Spacer的選擇：之前的研究認為(wei) ，按5’-protospacer-GG-3’的相對位置選取protospacer、並且以GG為(wei) PAM是比較合理的，但近期有人又建議，以guide-centric（5’-CC-3’）比target-centric(5’-GG-3’)更合理，於(yu) 是就按5’-CC-protospacer-3’的相對位置來設計spacer。

3.驗證mexB的敲除水平

（1）為(wei) 了驗證mexB敲除能力和修複能力，所使用/構建的質粒：

質粒pAY5211：空載質粒，具有卡那黴素抗性基因和Ptat啟動的lux（luminescence，熒光素）基因，作為(wei) 對照組。

構建質粒pAY5233：在有卡那黴素抗性的pMS402骨架的lux基因上遊用強啟動子Ptat表達靶向mexB的array序列，執行敲除mexB任務的質粒，稱為(wei) targeting plasmid。當mexB被剪切後，細菌genome常常會(hui) 紊亂(luan) ，導致自身的死亡；

構建質粒pAY5235：將一個(ge) 1kb的donor序列插入到pAY5233上，該序列由mexB的上遊和下遊的500bp的同源臂組成。質粒pAY5235稱為(wei) editing plasmid。若mexB被剪切出口子，在一些菌中，mexB的這兩(liang) 段同源臂會(hui) 和mexB同源重組，同源重組後這個(ge) gene就被修複好了，不會(hui) 阻礙genome的正常工作，使得pAY5235本身可以穩定存在，菌落呈現熒光狀態。

（2）檢驗基因敲除水平和功能性質粒對已編輯細胞的修複能力

實驗步驟：向菌中轉pAY5211（對照）、pAY5233（targeting plasmid）和pAY5235（editing plasmid），通過菌落克隆的熒光狀態判斷質粒轉化水平。

實驗結果和結論：

i.比較轉化pAY5211和pAY5233的兩(liang) 組：pAY5211組中表達有熒光素的陽性克隆多，pAY5233組中幾乎不存在表達有熒光素的陽性克隆，因此說明pAY5211的轉化成功率比pAY5233高的多，進一步證明pAY5233組中的菌內(nei) 發生了“detrimental chromosome cleavage”，導致細菌難以存活；這個(ge) 結果說明，靶向mexB的基因敲除成功並且敲除水平較高。

ii.把轉化pAY5235的組和前兩(liang) 組比較：pAY5235組出現了少量具有熒光的陽性克隆，說明部分細菌在mexB被敲除後進一步進行了同源重組、將genome修複，因此細菌可以正常存活，進而正常表達卡那黴素抗性和熒光素——這個(ge) 實驗證明了：由於(yu) 這個(ge) CRISPR係統執行的基因敲除而給基因組帶來的破壞是可以被修複的，也就是說，使用可編程質粒對細菌進行多輪編輯是可行的。下麵那張在試管培養(yang) 的圖同樣是在證明這一點。

（3）此外，本研究還表明，當target gene小於(yu) 1kb時，敲除的成功率會(hui) >90%。如下圖所示：

我的理解就是，這個(ge) 實驗是以mexB基因內(nei) 的不同長度的區域當作不同的target gene，通過判斷不同長度區域被完全剪切的效率來判斷不同長度的target gene的剪切成功率。下麵這個(ge) 實驗就在判斷mexB內(nei) 具體(ti) 有多長被切掉了。原理是，Cas2/3剪切target gene後會(hui) 剩下來長短不一的序列，用不同的引物去PCR，看能P下來的片段是完整長度的還是中間一段被剪切掉後兩(liang) 端剩下的長度，P下來完整長度就說明敲除失敗，P下來是隻有兩(liang) 側(ce) 剩餘(yu) 的長度就說明敲除成功。

由圖可以看出，和array靶向範圍（32bp）很近的50bp序列的敲除成功率是100%，比array靶向範圍稍遠的500bp序列的敲出成功率大約是87.5%，1000bp序列的成功敲除率也大概是87.5%，3000多bp時候（整個(ge) mexB基因）敲除率就大概隻有62.5%了。

3.利用CRISPR 係統對耐藥性機理探究

構建了ΔmexB、ΔmexF和ΔmexH突變體(ti) （對應參與(yu) 編碼下麵三個(ge) 外排泵的組分），並檢測了三個(ge) 外排泵MexAB-OprM、MexEF-OprN和MexGHI-OpmD對PA154197耐藥性的貢獻——轉錄組分析表明這些基因過表達。

ΔmexB和ΔmexF都引起了一些種類的抗生素的MIC（最小抑菌濃度）下移，ΔmexH沒有明顯帶來的MIC改變。作者進一步對ΔmexB和ΔmexF進行了組合敲除，比較其敲除單基因的MIC上的變化，最後得出結論：MexAB-OprM和MexEF-OprN同時過表達構成PA154197的主要耐藥決(jue) 定因素。

（本文剩下的內(nei) 容對耐藥性機製進行進一步的詳細研究，主要研究方法和“3”類似，就是用CRISPR機製敲除某一些基因，然後研究單基因對耐藥性的影響或多基因之間的關(guan) 係，這裏不再贅述）