IGEM文獻分享 Analytical Chemistry: 通過排阻色譜熒光檢測法定量分析細胞外膜小泡

文獻標題：Quantification of small extracellular vesicles by size exclusion chromatography with fluorescence detection

Doi號：10.1021/acs.analchem.6b03348

關(guan) 鍵詞：sEVs、Dil dye、尺寸排阻色譜、TK6細胞

摘要：

通過排阻色譜熒光檢測法定量分析細胞外膜小泡

一、背景介紹

目前通過簡便有效的方法對細胞外膜小泡進行量化仍然具有較大的挑戰，本文通過尺寸排阻色譜和熒光檢測（SEC-FD）的方法，進行外膜囊泡EV的定量。去除細胞和細胞碎片後，0.5mL的樣品（例如細胞培養(yang) 基）將會(hui) 和CM-Dil染料一起孵育，起到熒光標記的效果。培養(yang) 液在填充有瓊脂糖凝膠CL-4B的SEC柱上進行分離，對洗脫液在Ex553nm/Em570nm處進行熒光監測，以100nm的脂質體(ti) 作為(wei) 內(nei) 標，評估了SEC-FD方法的分離效率。在細胞培養(yang) 基分析中，我們(men) 獲得了基於(yu) SEC-FD峰高和sEVs濃度的線性校準曲線。有十分靠近1的回歸常數r2。

二、實驗過程

本文嚐試通過尺寸排阻色譜法，從(cong) 樣品的其他內(nei) 源性成分中，例如脂蛋白和氨基酸，分離sEVs，並主要通過SEC-FD方法對在無血清培養(yang) 基中培養(yang) 的TK6細胞的sEVs分泌進行監測。

圖1 高糊的定量意圖

1.細胞培養(yang)

TK6細胞在無血清培養(yang) 基中進行培養(yang) ，之所以使用無血清，是因為(wei) 血清中含有較多的EVs，將會(hui) 影響定量效果。

2.脂質體(ti) 準備：
使用脂質體(ti) 試劑盒製備多層脂質體(ti) ，使用過濾裝置通過孔徑為(wei) 100nm的多孔聚碳酸酯膜，擠出獲得的脂質體(ti) 懸浮液，獲得均勻大小的脂質體(ti) ，用動態光散射法DLS測量脂質體(ti) 粒徑大小。

3.儀(yi) 器準備：

向柱子中填充所選型號的瓊脂糖凝膠，並和熒光光譜儀(yi) 進行連接。

4.樣品處理：

在4℃條件下，以300rpm離心10min以去除細胞顆粒，然後在10000rpm下離心30min，去除細胞碎片，取0.5mL的上清液轉移到小管中，在37℃旋轉的條件下和2μL的CM-Dil染料混合孵育30min。在脂質體(ti) 內(nei) 標的過程中，無需進行離心處理，直接與(yu) 染料孵育即可。將培養(yang) 液加到SEC柱上，用PBS-NaCl緩衝(chong) 液進行洗脫，在553/570nm處進行熒光監測。

圖2 內(nei) 標結果示意圖

5.外泌體(ti) 定量：

對上述匯集出來的細胞培養(yang) 基中的樣品進行外泌體(ti) 量化。再次通過離心去除細胞碎片後，將5mL樣品和1mL的ExoQuick-TC（用於(yu) 沉澱外泌體(ti) ）在4℃混合孵育10h，接著使用ELISA試劑盒提供的CD63標準校正曲線，對樣品中的外泌體(ti) 進行定量。

6.其他：
由於(yu) 在洗脫過程中將會(hui) 出現兩(liang) 個(ge) 峰，我們(men) 通過DLS和TEM對洗脫液中的EV粒徑進行實時分析，發現6min時，洗脫出來的sEVs的平均粒徑在100nm到300nm之間，說明六分鍾時洗脫的就是外膜囊泡。同時測量蛋白質濃度的結果表明，在6min時收集的洗脫液的蛋白質含量增加，表明洗脫液中含有sEVs，能夠檢測到其表麵蛋白質含量的增加。另外，雖然使用此型號的凝膠柱能夠將sEVs和一些鹽類和DNA等分離，但是對於(yu) 分子大小差不多的某些脂蛋白，仍然無法分離，將被共同洗脫。通過標準的已知濃度的外泌體(ti) 溶液，進行梯度稀釋並進行SEC-FD分析，獲得校準曲線。最後發現SEC-FD的峰值和sEV的濃度呈正比關(guan) 係。

7.正式測量TK6細胞的外泌體(ti) 濃度：

用純淨的無血清培養(yang) 基和CM-Dil孵育來測定背景，其餘(yu) 操作按上述處理進行，得到熒光強度示意圖如下所示，下方右圖表示在培養(yang) 時間1-12h內(nei) ，實際上外膜囊泡的產(chan) 生量是很少的，在12h後開始大量產(chan) 生EVs。

圖3 測量TK6細胞外泌體(ti) 濃度結果示意圖