瑞士洛桑大學2021年iGEM課題Aprifreeze項目簡介

課題：2021-UNILausanne

主要內(nei) 容：

通過施用抗凍蛋白與(yu) 殺傷(shang) 丁香假單胞菌來保護植物免受凍害

關(guan) 鍵詞：

抗凍蛋白；尾生菌素；CRISPR/Cas；丁香假單胞菌

1.問題發現與(yu) 課題概述

2021年的早春，該iGEM課題所在地經曆了一次較為(wei) 嚴(yan) 重的霜凍：杏樹的花苞被凍壞了，導致杏果的大麵積減產(chan) 。

本課題準備從(cong) 兩(liang) 個(ge) 方麵來解決(jue) 這一問題。其一，生產(chan) 抗凍蛋白的保護液並施加給杏樹，來保護杏樹的敏感組織免受冰晶的損傷(shang) 。其二，在冷凍期防治丁香假單胞菌的病原侵害。這種病原菌會(hui) 形成冰核蛋白，促進冰晶的形成，增大霜凍期對杏樹的危害；而從(cong) 這一角度出發，本課題有表達植物尾生菌素和遞送CRISPR/Cas9係統兩(liang) 種互補的方法。

圖一

1.1抗凍蛋白

當溫度降到零攝氏度以下的時候，冰晶破壞細胞，特別是花苞、幼年果實等敏感組織與(yu) 器官。抗凍蛋白可以與(yu) 冰晶結合，抑製冰晶的生長，從(cong) 而減小冷凍期對植物的損害。

1.2噬菌體(ti) 源性的尾生蛋白（Tailocin）

Tailocin是衍生自噬菌體(ti) 的一種可以殺死競爭(zheng) 菌株的毒素，本課題中使用的Tailocin可以特異性地殺傷(shang) 丁香假單胞菌，而不損傷(shang) 其他的菌群。該類物質含有噬菌體(ti) 的尾絲(si) 結構，它可以穿透植物的細胞膜，殺死靶細胞。由於(yu) 這是噬菌體(ti) 來源的，所以它具有比較高的特異性。同樣的，我們(men) 仍然是利用大腸杆菌作為(wei) 底盤菌來表達Tailocin。

1.3噬菌體(ti)

丁香假單胞菌的冰核蛋白是由InaZ基因編碼的，如果將丁香假單胞菌的該基因沉默，那麽(me) 就能從(cong) 源頭上阻止丁香假單胞菌產(chan) 生冰核蛋白。本課題利用噬菌體(ti) 來遞送CRISPR/Cas9係統，並將該係統呈遞給丁香假單胞菌。

1.4證明方法

課題組成員設計了一款能夠準確調控溫度的降溫器，借助顯微鏡，可以監測樣品的冷凍過程。除此之外，本課題組還設計了一套算法程序，來量化冷凍對植物的損傷(shang) 。

2.抗凍蛋白詳述與(yu) 基因回路構建

抗凍蛋白的活性鑒定可以通過熱滯現象（TH）或再結晶抑製活性測試（IRI）來驗證。TH描述了非平衡凍結和融化溫度之間的差異；IRI活性指的是防止冰晶繼續長大的能力。不同的抗凍蛋白其所具有的活性是不一樣的，細菌源性的抗凍蛋白具有適宜的TH和IRI活性，而來自魚類或昆蟲的抗凍蛋白有很強的TH活性，但是IRI活性卻很低；來自植物的抗凍蛋白有很高的IRI，但其TH活性較低。本課題有三種候選的抗凍蛋白可供選擇：鬆皮天牛、胡蘿卜和黃杆菌的抗凍蛋白；抗凍蛋白在大腸杆菌中表達。

圖二 抗凍蛋白的選擇

圖三 抗凍蛋白表達的質粒構建

關(guan) 於(yu) 質粒構建，本課題所采用的主要方法是用pET-17b和pCold-I兩(liang) 種不同的載體(ti) 將其克隆到e.c oli BL21 (DE3)中，然後用IPTG誘導表達。最後利用磁珠、His-tag親(qin) 和柱和凝膠過濾對蛋白進行提取純化。pET-17b含有一個(ge) T7啟動子，可以調控重組蛋白的高水平表達。另一方麵，pCold-I包括一個(ge) 冷激蛋白a (cspA)啟動子，該啟動子允許較難表達和不能用T7係統表達的蛋白表達。因此，我們(men) 利用每個(ge) 載體(ti) 對AFPs的表達進行了比較，以優(you) 化其表達和合成。

圖四 重組蛋白的少量表達與(yu) 提取

3.噬菌體(ti) 尾生菌素Tailoicins的選擇與(yu) 回路構建

植物的凍傷(shang) 並不完全是物理因素造成的：有一些生活於(yu) 植物表麵的細菌種類， 它們(men) 能夠促進冰晶的形成。在理想情況下，就算是易受寒害的植物都能夠忍受-5℃至-10℃的冷凍侵襲，但是實際上，當溫度稍稍低於(yu) 0℃的時候，這些植物就會(hui) 被凍傷(shang) ，這就是由生存於(yu) 它們(men) 表麵的特殊的細菌導致的。在這些促進冰晶形成的細菌中，丁香假單胞菌就是一類典型的例子。

丁香假單胞菌可以產(chan) 生一種衍生自噬菌體(ti) 的細菌素：尾生菌素（Tailocins）。尾生菌素在結構上類似於(yu) 噬菌體(ti) 的尾管蛋白，是細菌用於(yu) 菌際競爭(zheng) 的一類物質，具有較好的特異性，不會(hui) 損傷(shang) 其他的菌種。尾生菌素會(hui) 結合在靶向細菌的細胞壁上，並在其上打孔，通過破壞氫離子梯度等方式來殺死靶細菌。

圖五 尾生菌素的作用機製示意圖

這種衍生自噬菌體(ti) 的尾生菌素，相較於(yu) 噬菌體(ti) 本身具有一定的優(you) 勢：

（1）宿主特異性（靶向性）較好，而且可以通過改變尾生菌素基因的靶向區域序列，來改變尾生菌素的靶向性；

（2）無法完成自我複製，如果被釋放到環境中可以最大程度降低生物安全問題。尾生菌素的表達在誘導型啟動子的基因回路中進行。

丁香假單胞菌有很多的菌株，杏樹上的丁香假單胞菌是一類致病菌株。本課題組成員們(men) 無法確定杏樹上生存的丁香假單胞菌是哪一類菌株，也沒有找到對應的文獻指明杏樹上的丁香假單胞菌對哪一種尾生菌素敏感（這與(yu) 我們(men) 副溶血性弧菌的課題的處境類似）。作為(wei) 概念證明，本課題組選擇了來自丁香假單胞菌DSM50252的尾生菌素，它可以靶向丁香假單胞菌B301D。這兩(liang) 種菌株都能夠被買(mai) 到（獲得比較容易），二者的基因組測序信息也已知。B301D雖然最早是在梨樹上被分離出來的，但是有文獻表明它也曾經在杏樹上被分離得到。

Tailocin基因是使用PHASTER鑒定的，這是一種能夠鑒定細菌基因組中的噬菌體(ti) 序列的工具。Tailocins含有原噬菌體(ti) 的大部分元素，但缺乏整合酶和衣殼基因。所有的基因都存在於(yu) 一個(ge) 單一的Cluster中，其中包含了細胞裂解所需的結構基因和酶。結果顯示，在我們(men) 的殺手菌株的基因組中同時存在一種原噬菌體(ti) 和一種tailocin。Tailocin簇長13.8 kb，包含17個(ge) 基因。有兩(liang) 種裂解酶:holin和溶菌酶。PHASTER將一些基因鑒定為(wei) 結構尾基因;其中一種被鑒定為(wei) 尾纖維，即負責目標識別和特異性的蛋白質。在尾纖維基因旁邊還存在一種伴侶(lv) 蛋白(尾纖維組裝蛋白)，幫助尾纖維正確折疊。最後，還有一些類似噬菌體(ti) 的基因，其功能尚未被PHASTER(假設蛋白質)明確識別。

圖六 尾生蛋白基因

接下來大致詳述一下尾生菌素在底盤菌（大腸杆菌）中的生產(chan) 過程。為(wei) 了使尾生菌素的生產(chan) 可控，本課題組成員在質粒構建中選擇了誘導型的啟動子（乳糖誘導型的T7啟動子），所使用的質粒骨架是pSG3651Plibt7A。完整的尾生菌素基因簇是非常大的（13.8kb），所以本課題中將基因簇分成了四段，從(cong) 菌體(ti) 中PCR擴增下來，並采用Gibson組裝的方法將片段連接在一起。

圖七 回路組裝示意圖

4.噬菌體(ti) 與(yu) CRISPR/Cas9方案

在本方案的最終目標裏，課題組成員希望隻沉默InaZ基因，而不去直接殺死丁香假單胞菌，最大程度上不破壞原生的微生物群。本課題中選用的是噬菌粒，這是一種類似於(yu) 質粒的DNA，能夠被包進缺陷型的噬菌體(ti) 中。當噬菌體(ti) 接觸到丁香假單胞菌時，能夠將噬菌粒注射進菌體(ti) ，讓噬菌粒發揮沉默基因的作用。

圖八 噬菌體(ti) 遞送噬菌粒的示意圖

在本課題組的係統中，Cas9蛋白產(chan) 生之後就與(yu) sgRNA結合在一起（與(yu) 靶標DNA分子結合）。當sgRNA靶向到了它的互補序列之後，Cas9蛋白會(hui) 誘導一個(ge) 雙鏈的剪切，打開DNA雙螺旋。

圖九 CRISPR/Cas9基因敲除與(yu) 同源重組修補

關(guan) 於(yu) 噬菌粒的構建與(yu) 相關(guan) 驗證實驗的設計，本課題將其劃分為(wei) 兩(liang) 個(ge) 步驟。本課題並不直接驗證基因工程改造的噬菌粒的效果，而是構建了與(yu) 噬菌粒相統一的一套質粒係統，將質粒轉化至B301D中，來驗證CRISPR係統對InaZ基因的敲除效率。