IGEM競賽文獻分享 bioRxiv: 無細胞生物傳感器診斷方麵新進展

文獻標題：

Evaluating and mitigating clinical samples matrix effects on TX-TL cell-free performa-nce

DOI號：

https://doi.org/10.1101/2022.05.02.489947

關(guan) 鍵詞:

合成生物學;顆粒;生物傳(chuan) 感器;診斷;臨(lin) 床樣本

摘要：

無細胞生物傳(chuan) 感器是一種很有前途的醫學診斷工具，但其性能可能會(hui) 受到來自樣本本身或外部組件的基質效應的影響。本文使用兩(liang) 個(ge) 報告係統，sfGFP和熒光素酶，係統地評估了血清、血漿、尿液和唾液中無細胞係統的性能。在所有情況下，臨(lin) 床樣本都有很強的抑製作用。在不同的抑製劑中，隻有RNase抑製劑能緩解基質效應。然而，他們(men) 發現RNase抑製劑的恢複潛力被商業(ye) 緩衝(chong) 液中甘油的幹擾部分減弱。他們(men) 設計了一種無需額外步驟就能產(chan) 生RNase抑製劑蛋白的菌株，從(cong) 而解決(jue) 了這個(ge) 問題。此外，他們(men) 的新提取物產(chan) 生了比以前條件更高的報告水平，並緩和了與(yu) 基質效應相關(guan) 的患者間可變性。這種統一於(yu) 多種臨(lin) 床樣本的無細胞係統魯棒性的係統評估和改進，是向開發適用於(yu) 多種疾病的無細胞診斷技術邁出的重要一步。

引入：

生物傳(chuan) 感器是一種檢測工具，它集成了來自傳(chuan) 感器模塊的生物識別元素，並將信號轉換為(wei) 快速、可測量的響應。快速護理點檢測應用是臨(lin) 床環境中複雜技術程序的替代方案，減少了耗時和依賴設備的樣品處理需求。因此，便攜式生物傳(chuan) 感器可以對慢性疾病進行密切監測，例如，便攜式葡萄糖監測設備徹底改變了糖尿病治療。這些工具適用於(yu) 對此類臨(lin) 床人群的實時評估，並更精確地確定臨(lin) 床結果。這樣，在考慮到患者自身環境和可變性的情況下，可以在臨(lin) 床環境之外簡單、重複地取樣，從(cong) 而減少偏倚數據。此外，在資源匱乏的環境中，生物傳(chuan) 感器是特別有前途的現場診斷工具，特別是在艾滋病毒、瘧疾或寨卡病毒等傳(chuan) 染性傳(chuan) 染病和地方病的情況下。許多國家對COVID-19的檢測反應不佳，這凸顯了在全球範圍內(nei) 快速、低成本和易於(yu) 分發的診斷設備的重要性。

無細胞表達係統作為(wei) 多功能生物傳(chuan) 感器工程的有前途的候選者的優(you) 勢：

1、支持複雜的基因電路的操作。

2、需要較小的反應量。

3、與(yu) 全細胞生物傳(chuan) 感器相比，無細胞係統可以檢測核酸等不能跨細胞膜的分子，以及對活細胞有毒性的分子。

4、除了非生物和非複製，幾乎不需要生物遏製措施，細胞無表達係統不承受進化壓力，可以改變全細胞生物傳(chuan) 感器。

5、反應可以在環境溫度或體(ti) 溫下發生。例如，通過將傳(chuan) 感器貼在皮膚上，消除了在檢測點使用孵化器等設備。

6、性能很容易通過不同的提取物和質粒組成來調整，並且蛋白表達產(chan) 量可以通過多種方法進行優(you) 化。

7、無細胞生物傳(chuan) 感器可以凍幹並在室溫下保持穩定長達一年，而且可以在不到一小時內(nei) 提供快速反應。

8、工程細胞自由轉錄和翻譯(TX-TL)係統與(yu) 電化學平台的結合進一步實現了多種生物標誌物的檢測。

總之，無細胞係統具有反應時間短、儲(chu) 存時間長、與(yu) 納米電極界麵兼容等優(you) 點，是臨(lin) 床和偏遠地區進行病理生物標誌物即時檢測的理想選擇。分散的便攜式診斷技術的出現可能會(hui) 改善全球流行病學數據的獲取，事實證明，這些數據對於(yu) 製定全球衛生保健措施以減輕非傳(chuan) 染性疾病和近期疫情(如寨卡或COVID-19大流行)的影響至關(guan) 重要。目前，一些問題限製了無細胞診斷平台的臨(lin) 床應用，如非識別標誌物的交叉檢測，或最重要的是，來自生物樣本的幹擾。複雜樣品成分的可變性甚至會(hui) 影響精密分析儀(yi) 器的讀數，這種現象被稱為(wei) 基質效應，可能會(hui) 產(chan) 生不準確的結果。這些效應在大腸杆菌提取物中產(chan) 生的幾種生物傳(chuan) 感器中都有報道，這些生物傳(chuan) 感器已經用人類樣本進行了測試(表1)。

表1

盡管無細胞生物傳(chuan) 感器的最終目標是它們(men) 的現場部署和病原生物標誌物的即時檢測，但隻有很少的研究係統地評估了無細胞生物傳(chuan) 感器在多種不同類型的人體(ti) 生物樣本中的性能。在這裏，他們(men) 通過微創方法監測了四種類型的臨(lin) 床樣本中大腸杆菌TX-TL無細胞提取物的性能，這些樣本取自醫院環境中的患者。樣本在檢測前未進行處理，除非在其基礎準備階段(即在適當的真空管中收集後進行血清和血漿的血液離心)。他們(men) 測試了樣品對本構製備的超級折疊綠色熒光蛋白(sfGFP)和螢火蟲熒光素的基質效應。

此外，他們(men) 係統地研究了添加RNase和蛋白酶抑製劑對大腸杆菌TX-TL無細胞係統的改善。重要的是，他們(men) 發現商業(ye) RNase抑製劑中的甘油會(hui) 減少遊離細胞的產(chan) 生。因此，他們(men) 開發了一種大腸杆菌菌株，它可以在提取液生產(chan) 過程中不需要任何額外的步驟就能在原位生產(chan) 自己的RNase抑製劑，同時消除了商業(ye) 抑製劑的成本，並增加了臨(lin) 床樣品中比使用時獲得的蛋白質產(chan) 量。最後，他們(men) 通過檢測10個(ge) 血清、血漿和尿液樣本來檢驗患者間的變異效應。

他們(men) 的新提取物降低了患者間的差異，尤其是血漿樣本。通過探索不同類型臨(lin) 床樣本的集合和個(ge) 體(ti) 患者樣本的影響，並提供一種更簡單的方法來減輕其基質影響，他們(men) 的結果代表著在開發針對一係列生物標誌物和病理條件的無細胞診斷方麵邁出了重要的一步。

結果：

在無細胞生物傳(chuan) 感器中，臨(lin) 床樣本基質強烈抑製報告基因的產(chan) 生。

他們(men) 首先測量了各種臨(lin) 床樣本(血清、血漿、尿液和唾液)對細胞遊離活性的基質效應。為(wei) 此，他們(men) 監測了在臨(lin) 床樣本存在或不存在的情況下，superfolder GFP (sfGFP)和螢火蟲熒光素酶(Luc)這兩(liang) 種組成型表達報告基因的產(chan) 生。他們(men) 選擇sfGFP和熒光素酶是因為(wei) 它們(men) 都是廣泛用於(yu) 信號量化的常見報告因子。將組成型表達sfGFP或熒光素酶的質粒與(yu) 大腸杆菌TX-TL提取物混合，該提取物是如前所述使用法國印刷機製備的，以及包含轉錄和翻譯所需的構建塊、鹽和能量源的優(you) 化緩衝(chong) 液。最後，由於(yu) 這些核心反應組分占可用反應體(ti) 積的80-90%，將未加工的臨(lin) 床樣品以最終反應體(ti) 積的10%加入反應混合物(圖1A)。

他們(men) 量化了在沒有或存在RNase抑製劑和兩(liang) 種蛋白酶抑製劑(細菌和哺乳動物)的情況下，不同臨(lin) 床樣本對組成性報告基因表達的基質效應，相對於(yu) 沒有臨(lin) 床樣本或抑製劑的陽性對照(圖1B-C)。他們(men) 發現盡管程度不同，所有臨(lin) 床樣本對報告基因的產(chan) 生都有抑製作用。在沒有任何抑製劑的情況下，血清和血漿幾乎完全阻礙報告基因的產(chan) 生(在沒有樣品添加的情況下，>98%的抑製)。在沒有添加樣品的情況下，尿液抑製了sfGFP和Luc報告基因產(chan) 生的90%以上，而唾液對這兩(liang) 種報告基因產(chan) 生的幹擾最小(相對於(yu) 對照組，對熒光素酶抑製70%，對sfGFP抑製40%)。

圖1

圖1注：

有害的臨(lin) 床樣本基質對報告基因表達的影響被商業(ye) RNase抑製劑部分恢複。A.將編碼sfGFP和熒光素酶蛋白的質粒與(yu) 大腸杆菌細胞提取物、優(you) 化的反應緩衝(chong) 液和臨(lin) 床樣本(血清、血漿、尿液或唾液)混合。c。矩陣效應的量化。將100 nM組成型表達sfGFP (B)或熒光素酶(C)質粒加入到含或不含10%臨(lin) 床樣本的無細胞係統中，包括小鼠RNase抑製劑(mRI)、細菌蛋白酶抑製劑(pI)或哺乳動物蛋白酶抑製劑(mPI)。相對於(yu) 陽性對照(無臨(lin) 床樣本或抑製劑)，所有測量均歸一化。每個(ge) 臨(lin) 床樣本是來自三個(ge) 不同個(ge) 體(ti) 的一個(ge) 池。數據是在三個(ge) 不同的日子裏進行的三個(ge) 實驗的平均值。誤差條對應±SD。

商業(ye) RNAse抑製劑可部分恢複細胞的遊離活性，而蛋白酶抑製劑對基質效應的緩解效果較差

他們(men) 測試了兩(liang) 類抑製酶活性的添加劑:RNAse和蛋白酶。RNAse抑製劑以前在某些類型的臨(lin) 床樣本中被證明可以提高細胞遊離反應的效率，或者用生物液體(ti) 係統地添加到細胞遊離反應中。此外，來自大腸杆菌提取物的內(nei) 源性蛋白酶也被認為(wei) 會(hui) 影響蛋白質合成的產(chan) 量。他們(men) 選擇測試細菌和哺乳動物的蛋白酶抑製劑，以解釋在大腸杆菌提取物和人類臨(lin) 床樣本中發現的蛋白酶。

添加RNase抑製劑後，尿液中sfGFP的產(chan) 量提高了約70%，血清中提高了20%，血漿中提高了40%，而在任何臨(lin) 床樣本中，細菌和哺乳動物蛋白酶抑製劑都未能提高細胞自由反應性能(圖1B)。當使用螢火蟲熒光素酶報告時，結果在所有條件下都是可比性的。添加RNase抑製劑可以恢複唾液、血漿、血清以及尿液中的熒光素酶信號，在沒有臨(lin) 床樣本的情況下，熒光素酶的產(chan) 量達到50%(圖1C)。與(yu) sfGFP一樣，細菌和哺乳動物蛋白酶抑製劑並沒有對細胞遊離蛋白合成產(chan) 生顯著的改善。

甘油存在於(yu) 酶抑製劑的商業(ye) 緩衝(chong) 液中，在無細胞反應中負責信號降解

雖然RNAse抑製劑在臨(lin) 床樣本存在時通常導致蛋白產(chan) 量增加，但在所有情況下，完全信號(即沒有臨(lin) 床樣本存在時)從(cong) 未恢複。此外，他們(men) 在沒有任何臨(lin) 床樣本的情況下測試了抑製劑在無細胞反應中的作用(補充圖1)，並觀察到所有抑製劑都降解了報告基因的產(chan) 生，其中RNase抑製劑是最有害的(與(yu) 沒有抑製劑相比，信號減少了約50%)。

他們(men) 想知道商業(ye) RNAse抑製劑的緩衝(chong) 成分可能是導致這種現象的原因。首先，他們(men) 比較了加入和不加入RNase抑製劑與(yu) 製造商列出的相同成分的緩衝(chong) 液(50 mM KCl, 20 mM HEPES, 8 mM DTT, 50%甘油)的無細胞反應效率(圖2A)。確實，添加RNase抑製劑的蛋白質產(chan) 量明顯下降，這與(yu) 單獨添加緩衝(chong) 液是相同的。在一係列質粒濃度範圍內(nei) ，這一結果是一致的(補充圖2)。為(wei) 了弄清楚緩衝(chong) 液的哪一部分是負責的，他們(men) 分別將商業(ye) 緩衝(chong) 液的每一種成分分別加入到無細胞反應中，包括單獨和所有可能的組合(圖2B)。他們(men) 發現，在所有情況下，單獨的甘油(在1%的最終反應濃度下)占sfGFP產(chan) 量下降的原因，而與(yu) 緩衝(chong) 液中任何其他成分的存在無關(guan) 。這些數據表明，添加RNase抑製劑時觀察到的遊離細胞反應性能的下降完全是由於(yu) 緩衝(chong) 溶液中含有甘油。

原位生產(chan) RNase抑製劑可以提供與(yu) 商業(ye) 抑製劑相同的保護，同時可以產(chan) 生更高的報告基因

然後他們(men) 假設，他們(men) 可以通過在大腸杆菌中表達RNase抑製劑來避免甘油抑製，同時培養(yang) 無細胞提取物。這將防止甘油的需要，並有降低總反應成本的額外好處。他們(men) 將經過密碼子優(you) 化的小鼠RNase抑製劑(mRI)基因克隆到T7啟動子下的質粒中，然後將其轉化到感受態大腸杆菌中進行提取。由於(yu) 在生長過程中添加IPTG是原位產(chan) 生T7 RNA聚合酶的一種常見的無細胞操作，因此將mRI基因置於(yu) T7啟動子下將允許高mRI生成，並且可能在此過程中不需要額外步驟(圖2C)。

圖2

圖2注：

mRI摻雜提取物產(chan) 生更大的蛋白，並調節患者間基質效應。A.臨(lin) 床樣本(血清、血漿、尿液)與(yu) 緩衝(chong) 液、10 nM sfGFP DNA和三種大腸埃菌提取條件之一混合:標準提取液、商業(ye) mRI標準提取液或現場生產(chan) mRI摻雜提取液。B.每個(ge) 樣品的基質效應的量化。熒光強度歸一化為(wei) 等效濃度的FITC (nM)。C.與(yu) 商業(ye) mRI標準提取物相比，mRI摻雜的sGFP產(chan) 量的Fold change。每個(ge) 臨(lin) 床樣本是三個(ge) 不同個(ge) 體(ti) 的池。數據是在兩(liang) 個(ge) 不同的日子裏進行的兩(liang) 個(ge) 實驗的平均值。誤差條對應±SD。D.每個(ge) 臨(lin) 床樣本的個(ge) 別患者sGFP生產(chan) 情況。10名患者的樣本在3個(ge) 不同的天內(nei) 獨立進行測量。彩色實點和細灰線表示每個(ge) 患者的平均值和標準差。實藍線表示種群的平均值和標準差。

大多數檢查無細胞生物傳(chuan) 感器開發和優(you) 化的研究使用混合臨(lin) 床樣本或臨(lin) 床樣本的人工等價(jia) 物。他們(men) 認為(wei) ，他們(men) 的係統沒有直接測量任何生物標誌物的存在，代表了研究患者之間基質變異的最佳基準機會(hui) 。此外，他們(men) 希望測試mRI原位生成是否能進一步減輕患者間基質效應。他們(men) 連續三天檢查了10個(ge) 不同患者的血清、血漿和尿液樣本，確保了商業(ye) 抑製劑或mRI摻雜提取物的測量之間的獨立性(圖3D)。在所有情況下，當使用摻雜mRI提取液時，數據的分散度都較低，尤其是血漿和尿液。這些結果突出表明，盡管使用RNase抑製劑可以改善蛋白質生產(chan) ，但開發具有足夠魯棒性的無細胞診斷方法可能仍麵臨(lin) 重大挑戰，以適應在護理點環境中患者樣本和采樣條件之間的差異。

討論：

他們(men) 的工作流程提供了關(guan) 於(yu) TX-TL無細胞生物傳(chuan) 感器在各種臨(lin) 床人體(ti) 樣本中的性能的統一數據和係統研究。他們(men) 研究和比較了複雜介質中的基質效應，並評估了簡單和可重複的優(you) 化策略。他們(men) 進一步研究了可能對傳(chuan) 感器性能有有益影響的抑製劑的擴展範圍，包括哺乳動物和蛋白酶抑製劑。對人類生物樣本的幹擾和可能的優(you) 化策略的了解對於(yu) 將無細胞生物傳(chuan) 感器應用於(yu) 具有廣泛病理條件的真實臨(lin) 床人群非常重要。這一步驟對於(yu) 實現其作為(wei) 下一代快速、低成本現場診斷平台的潛力至關(guan) 重要。他們(men) 的程序簡單、可重複，並可用於(yu) 實際的臨(lin) 床環境，以大規模驗證TX-TL無細胞生物傳(chuan) 感器的使用。

他們(men) 的工作流程的優(you) 點之一是沒有樣品預處理，這需要大量的技術方法，如分析物提取或蛋白質相分離。唯一的樣品處理是標準的離心程序，用於(yu) 從(cong) 全血管中獲得血清和血漿。他們(men) 的數據支持將無細胞生物傳(chuan) 感器擴展到偏遠環境下的各種新鮮人體(ti) 樣本，而不需要複雜的技術樣本處理。在需要血漿或血清的化驗中，這些生物傳(chuan) 感器可以與(yu) 低技術含量的離心機(如造紙離心機或打蛋離心機)結合，用於(yu) 樣品製備。

他們(men) 比較了兩(liang) 個(ge) 著名的報告模塊，sfGFP和熒光素酶，在各種臨(lin) 床樣本中的信號輸出。盡管唾液的抑製作用最小，但在所有病例中，臨(lin) 床樣本的添加都強烈地抑製了報告信號。血清和血漿中添加RNAase抑製劑後，性能顯著下降和部分恢複可能與(yu) 動脈、靜脈和毛細血管內(nei) 皮細胞分泌大量胰腺型核糖核酸有關(guan) 。

類似地，人類的尿液長期以來被認為(wei) 含有多種RNase活性。有趣的是，雖然人類唾液可以表現出核糖核酸酶活性，特別是在某些病理條件下，但他們(men) 的結果表明，它本身並不總是對樣本基質效應有顯著貢獻。sfGFP作為(wei) 即時診斷報告的一個(ge) 潛在缺點是需要生產(chan) 低成本的設備，可以激發熒光蛋白並過濾發射信號;然而，其他研究小組已經在設計3D打印熒光閱讀器，這種閱讀器可以很好地實現這一目的。與(yu) sfGFP的使用相比，在臨(lin) 床環境中使用熒光素酶的缺點是需要添加熒光素酶底物(熒光素)來觸發發光。然而，與(yu) 熒光素相關(guan) 的傳(chuan) 感器具有為(wei) 不需要外部光源刺激的簡單光學裝置提供可檢測信號的優(you) 勢。一些研究報道了用智能手機攝像頭進行簡單的信號檢測，可以很容易地在病人床邊處理。此外，其他誘導顏色變化的記者，如LacZ或C23DO，可以提供一個(ge) 簡單的，可視的輸出結果。（這裏是不是可以在讀取部分簡化硬件？）

RNAse抑製劑的某些特定作用可能被減弱，損害了信號的完全恢複。他們(men) 發現RNase抑製劑商業(ye) 緩衝(chong) 液中含有的甘油是導致細胞遊離反應效率降低的原因。雖然甘油抑製無細胞反應的證據以前已經報道過，但目前缺乏無甘油RNase抑製劑排除了另一種可行的商業(ye) 選擇。他們(men) 決(jue) 定通過設計一個(ge) 可以在提取液製備過程中產(chan) 生原位mRI的大腸杆菌質粒來避開甘油效應。他們(men) 發現，在細胞生長階段，通過在T7啟動子的控製下產(chan) 生mRI，他們(men) 創造了一種細胞提取物，可以保護細胞免受RNaseA和商業(ye) RNase抑製劑的影響，而不需要緩衝(chong) 甘油的整體(ti) 信號降低效應。此外，由於(yu) 不含甘油，該提取物在臨(lin) 床樣本中表現出更高的信號。雖然最近的出版物也有類似的方法生產(chan) mRI來幫助防止臨(lin) 床基質效應，但它們(men) 需要多重反應，或在不同溫度下生長的多重提取物與(yu) 額外的折疊伴侶(lv) 物的組合。相比之下，他們(men) 的菌株不需要任何額外的步驟，除了在細胞生長過程中添加IPTG，這已經是在無細胞提取物中誘導T7聚合酶產(chan) 生的常見做法。

最後，他們(men) 使用一種商業(ye) 抑製劑和他們(men) 的摻雜mRI提取物檢查了三種不同臨(lin) 床樣本(血清、血漿和尿液)的患者間可變性。通過使用每一種物質的10個(ge) 個(ge) 體(ti) 樣本，他們(men) 發現，當使用摻雜提取物時，基質效應在患者之間產(chan) 生的變異性較小，特別是對血漿和尿液。這種使用大量個(ge) 體(ti) 患者的驗證，對於(yu) 開發新的生物傳(chuan) 感器至關(guan) 重要，因為(wei) 他們(men) 表明，基質效應可以如此顯著，以至於(yu) 在一個(ge) 患者的尿液樣本中完全消除蛋白質的產(chan) 生。由於(yu) 尿液中不同離子和代謝物的濃度會(hui) 因患者的水合作用而有很大的差異，所以看到尿液中有很大的差異也許並不令人驚訝;然而，這些發現強調，在無細胞診斷能夠可靠地用於(yu) 即時護理環境之前，仍然需要對無細胞診斷進行顯著的魯棒性設計。有趣的是，血漿顯示了最低的患者間變異性。血漿和血清可以經常互換使用，獲得血清的凝血過程會(hui) 導致某些血小板成分的變化，如天冬氨酸轉氨酶、乳酸脫氫酶、纖維蛋白/纖維蛋白原和血清素。進一步的研究可能會(hui) 研究哪些成分會(hui) 特別影響遊離細胞的表達，但他們(men) 的工作表明，血漿可能是一個(ge) 很好的臨(lin) 床樣本，因為(wei) 在慢性疾病或長期隨訪研究或診斷中，需要高度的重現性。

總的來說，這些結果代表了使用無細胞係統對未經處理的樣品進行臨(lin) 床診斷的一些希望和潛在挑戰的全麵概述。除了提供一個(ge) 數據集，在一組統一的實驗中比較四種常用的臨(lin) 床樣本，據他們(men) 所知，它代表了血漿第一次被用於(yu) 無細胞反應。此外，唾液特別有趣，因為(wei) 它涉及一種無痛、非侵入性的收集過程，可以潛在地用於(yu) 監測神經退行性疾病和神經精神疾病的進展，如自閉症、阿爾茨海默氏症、帕金森氏症和亨廷頓氏病，以及口腔微生物群。與(yu) 牙齒和牙周健康有關(guan) 。向更廣泛的臨(lin) 床樣本開放無細胞生物傳(chuan) 感器，並通過係統優(you) 化確保其可靠性，將有助於(yu) 提供便攜、低成本的診斷工具，以應對全球衛生挑戰。