2022 HKUST iGEM課題分享

iGEM課題分享——Fisherly

iGEM 2022 HKUST

Achievements: Special Award - Safety and Security Award, GOLD medal

Nomination:Best Sustainable Development Impact, Best Integrated Human Practices, Best WIKI, Best Presentation

1、Background

香港是亞(ya) 洲第二大以及全球第八大人均海產(chan) 消費市場。2021年，香港海產(chan) 進口量為(wei) 33,000噸，海產(chan) 產(chan) 量高達112,000噸。海產(chan) 無疑是香港人民餐桌上必不可少的一部分。但是由於(yu) 魚類運輸和儲(chu) 存不當等問題，魚類腐敗的情況時有發生，魚類腐敗主要會(hui) 帶來三大問題：產(chan) 品變質、食物浪費、生物胺中毒。生物胺中毒會(hui) 出現皮疹、頭暈惡心、嘔吐、心悸呼吸困難等症狀。

研究表明，生物胺可以作為(wei) 衡量魚類腐敗程度的重要指標。通過表征生物胺濃度，可以反映魚類是否腐敗，但是目前的檢測手段價(jia) 格昂貴且耗時較長。所以2022年HKUST團隊開發了一種方便快捷的生物胺檢測試劑盒，旨在有效表征樣本中的生物胺含量。

2、Design

生物胺傳(chuan) 感器包含三個(ge) 模塊：感應模塊、處理模塊、色度輸出模塊。

1.感應模塊

在底盤微生物中表達二胺氧化酶 （rDAO），將胞外的生物胺信號轉換為(wei) 底盤細胞能夠胞內(nei) 探測的H₂O₂信號。

圖1 rDAO所介導的反應

通過建模分析發現增加rDAO胞內(nei) 濃度可以使最後色度輸出更明顯，表征效果更好。但是rDAO具有二硫鍵，在原核生物細胞還原性的環境中不易形成，於(yu) 是團隊將rDAO與(yu) 易位標簽PelB相連，希望將rDAO運到還原性相對較弱的周質空間中形成，以增大其濃度。

圖2 PelB-rDAO的表達

2.處理模塊和色度輸出模塊

這兩(liang) 個(ge) 模塊在基因線路的設計上是相融合的，本質上是將H₂O₂作為(wei) 輸入，輸出不同的色度，以此反映H₂O₂的濃度，從(cong) 而反映生物胺的濃度。

2.1 TEV（煙草蝕紋病毒）蛋白酶表達模塊

OxyR是E.coli 的轉錄因子 ，有兩(liang) 個(ge) -SH（巰基），H₂O₂將OxyR氧化後，氧化型的OxyR便可以激活OxyR誘導型啟動子katG，開啟TEV蛋白酶的轉錄。

圖3  OxyR的作用機製

TEV蛋白酶可以特異性識別氨基酸序列（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-cut site-Ser），並在穀氨酰胺和絲(si) 氨酸之間進行切割，從(cong) 而實現對於(yu) 紅色熒光蛋白（RFP）的信號擴大以及對於(yu) 綠色熒光蛋白（GFP）的信號減弱。

圖4  TEV蛋白酶切割機製

2.2 針對RPF的降解救援以擴大RFP信號輸出

用一種馬鈴薯Y病毒ssrA RNA在RFP的C末端添加LVA降解標簽，該標簽可以使被標記的蛋白被大腸杆菌細胞質中內(nei) 源性的蛋白酶ClpXP和ClpAP識別和降解。

圖5 低生物胺濃度時降解救援的表達通路

在低生物胺濃度時，過氧化氫濃度低，OxyR大部分處於(yu) 還原型，TEV蛋白酶不表達。組成型表達的RFP因其C端帶有LVA降解標簽，被大腸杆菌內(nei) 源性蛋白酶ClpXP和ClpAP識別降解，紅色信號弱。

圖6 高生物胺濃度時降解救援的表達通路

在高生物胺濃度時，過氧化氫濃度高，OxyR被氧化活化，從(cong) 而誘導TEV蛋白酶表達，切割去除LVA標簽，從(cong) 而實現對於(yu) RFP的“救援”，擴大紅色信號輸出。

2.3 針對GFP的誘導降解係統

令GFP+LVA降解標簽+TEV切割位點+抑製序列處於(yu) 同一通路中。抑製序列來源於(yu) mRFP C末端的77個(ge) 氨基酸，可以屏蔽LVA標簽，因此抑製序列存在時內(nei) 源性大腸杆菌蛋白酶ClpXP和ClpAP不能識別和降解GFP。

圖7 低生物胺濃度時誘導降解的表達通路

在低生物胺濃度時，與(yu) 之前原理相同，TEV蛋白酶不表達。組成型表達GFP-LVA-cut site-IS融合蛋白，IS可以掩蔽LVA標簽不被識別降解，從(cong) 而綠色信號強。

圖8 高生物胺濃度時誘導降解的表達通路

在高生物胺濃度時，TEV蛋白酶表達。切割去除抑製序列，使得LVA標簽暴露，GFP被誘導降解，綠色信號弱。

所以最終結果如下表所示。

3、Results

1.使用茚三酮與(yu) 生物胺反應表征rDAO

分別將帶有引導序列pelB-rDAO，rDAO和空載質粒轉入底盤。過夜培養(yang) 後，將過夜培養(yang) 的細胞稀釋至1.0 OD₆₀₀，接種到液體(ti) LB，然後加入屍胺至600 ppm濃度，搖床培養(yang) ，0 h、1 h、2 h分別用茚三酮法測屍胺濃度，得到結果如圖9。

圖9  pelB標簽功能驗證

對於(yu) -ve（空載對照），沒有看到顯著的減少或增加，說明組胺的蒸發和細菌培養(yang) 對我們(men) 實驗結果的影響可以忽略不計。rDAO組可見，隨時間增加濃度有下降，代表rDAO表達正常，但0 h和1 h以及1 h和2 h之間無統計學意義(yi) 上的顯著差異，僅(jin) 0 h和2 h存在顯著差異，表明rDAO活性較低。pelB-rDAO組表明，pelB對於(yu) rDAO的活性有促進作用，使得隨時間變化濃度變化極其顯著，驗證了增加pelB的合理性。

2.通過熒光檢測表征OxyR誘導型啟動子OxyS和KatG

構建6種表達載體(ti) ，分別是oxySp-GFP-Pc-OxyR、katGp-RFP-Pc-OxyR、oxysp-GFP、pc-OxyR、katGp-RFP以及陰性對照組。

圖10  oxySp-GFP-Pc-OxyR與(yu) katGp-RFP-Pc-OxyR基因線路

圖11  GFP組歸一化熒光/OD₆₀₀ v/s [H₂O₂]

圖12  RFP組歸一化熒光/OD₆₀₀ v/s [H₂O₂]

圖13  oxySp-GFP-Pc-OxyR與(yu) katGp-RFP-Pc-OxyR熒光強度比較

在GFP相關(guan) 組以及RFP組，陰性對照為(wei) 基準，在分別表達GFP和RFP的係統中，隨著過氧化氫濃度的升高，目的熒光強度也對應升高，表明兩(liang) 獨立係統構建成功。

將兩(liang) 係統表達強度放在一起進行比較，可見RFP表達強度低於(yu) GFP，為(wei) 了使最終濃度下顏色變化明顯，需要進行優(you) 化，此實驗對之後的操作具有指導意義(yi) 。

3.降解救援機製中TEV蛋白酶切除LVA標簽的表征

構建3種載體(ti) ，pTac-TEV-Pc-RFP-LVA 、pTac-TEV-Pc-RFP 和空載質粒，分別轉入底盤。無實驗結果。

4.誘導降解機製中TEV蛋白酶切除抑製序列的表征

構建4種載體(ti) ，pTac-TEV-Pc-GFP-LVA-CS、pTac-TEV-Pc-GFP-LVA- CS-IS、pTac-TEV-Pc -GFP和空載質粒，分別轉入DH5α和BL21菌株中。

圖14  TEV蛋白酶切除抑製序列效果表征

陰性對照為(wei) 基準，灰色曲線表明，隨著IPTG濃度升高，LVA促使GFP降解。綠色曲線在IPTG濃度較低時，TEV表達少，GFP帶有IS掩蔽LVA，隨著IPTG濃度上升，TEV表達上升促使GFP降解。

5.製作無細胞係統

通過比較後發現大腸杆菌BL21菌株更適合用於(yu) 製作無細胞係統，之後團隊對無細胞係統的組分和反應條件做了一係列優(you) 化，最終確定無細胞係統體(ti) 係為(wei) 1.5 mL，鎂離子濃度為(wei) 15 mM、PEG濃度為(wei) 3%、ATP濃度為(wei) 3 mM、3-PGA濃度為(wei) 10 mM、孵育溫度為(wei) 37℃。

6.無細胞係統功能驗證。

他們(men) 發現由OxyR調控表達的GFP濃度與(yu) 過氧化氫濃度並不具有明顯線性關(guan) 係，據此，他們(men) 對於(yu) 對應模板進行電泳檢測，結果發現條帶由彌散趨勢，RNA汙染嚴(yan) 重，說明需要重新核驗樣品純度。

圖15 電泳檢測結果

4、HP

市場：

1.1與(yu) Seafood Friday公司進行會(hui) 議商討，詢問常規保藏操作以及質量檢查問題，並詢問他們(men) 對於(yu) 設計的意見。

1.2 與(yu) M&C的高管商議，獲得了他們(men) 對於(yu) 目標用戶以及硬件設計的意見。

1.3 提出了菜市場漁業(ye) 的健康安全問題

1.4 在泰國進行線下調研

政策：

與(yu) 負責監管批發魚類市場運作的香港魚類營銷組織（FMO）和負責香港農(nong) 業(ye) 和漁業(ye) 的漁農(nong) 自然護理署（AFCD）的工作人員交流，了解到目前魚類質量監管的不完善之處。

消費者：

提出了海產(chan) 消費者訴求，需要更嚴(yan) 格的商品控製，消費者的食物安全比價(jia) 格重要。