2021 NUS_Singapore iGEM課題分享

iGEM課題分享

2021 NUS_Singapore

Photo-Regulated Yeast for Synbio Manufacturing

Background

新加坡麵積小，人口密度高，需要提高糧食產(chan) 量，增加糧食自給率。因此，選擇垂直種植的方法來提高單位麵積的種植密度。但高密度的作物使病蟲害更容易傳(chuan) 播，導致產(chan) 量的下降。

因此，該團隊希望設計一種工程菌，用於(yu) 生產(chan) 人類β-防禦素（HBD）作為(wei) 生物殺蟲劑，以解決(jue) 危害垂直種植的病蟲害問題。該團隊利用光遺傳(chuan) 學實現了工程菌的三種功能：紅光誘導酵母生產(chan) 和分泌人類β-防禦素；藍光誘導酵母X型絮凝；兩(liang) 種光激活自殺開關(guan) ，殺死酵母。

Genes

EL222 蛋白是一種來自海濱芽孢赤杆菌的光敏轉錄因子，與(yu) C120 啟動子一起組成光遺傳(chuan) 轉錄係統，能夠通過藍光控製目的基因的表達。暴露在藍光下時，EL222 能夠形成二聚體(ti) ，與(yu) C120 序列結合。

TALE 是由黃單胞菌分泌的天然Ⅲ型效應蛋白，具有DNA結合域（DBD）和激活域（AD）.其中心重複序列（CRD）包含了用於(yu) 序列特異性DNA結合的保守的34個(ge) 氨基酸重複序列，因此是一類可編程的DNA結合蛋白。

FLO1是參與(yu) 絮凝的凝集素樣蛋白。作為(wei) 一種細胞壁蛋白，能夠結合其他細胞表麵的甘露糖鏈，賦予酵母形成絮凝物的能力。

Design

新加坡國立大學團隊利用光誘導係統控製生物農(nong) 藥人類β-防禦素與(yu) 絮凝相關(guan) 蛋白Flo1的合成以及誘導工程菌自殺。

首先，將啟動子上遊的活化序列取代為(wei) SynPALE靶向的DNA序列。PhyB與(yu) PIF3分別是光敏色素和為(wei) 光敏色素相互作用因子，在紅光存在的情況下，他們(men) 會(hui) 相互靠近。因此，將TALE的DNA結合域與(yu) PhyB融合，激活域與(yu) PIF3融合，SynTALE-PhyB就會(hui) 結合在啟動子上遊，當紅光存在時，PIF3-AD就會(hui) 與(yu) SynTALE-PhyB結合，激活域AD靠近啟動子啟動下遊基因的轉錄。HY1 和 PcyA 蛋白參與(yu) 生色團合成，為(wei) 了使 PhyB 正常發揮功能，需要引入這兩(liang) 個(ge) 基因。

同樣地，將核定位信號融合的 EL222 蛋白與(yu) VP16 活化結構域融合，得到融合蛋白。暴露在藍光下時，以單體(ti) 存在的 EL222 蛋白改變構象，暴露 LOV 結構域和 HTH（helix turn helix）結構域形成與(yu) 靶 C120 序列結合的二聚體(ti) ，激活域接近啟動子而啟動下遊轉錄，產(chan) 生 Flo1 蛋白，造成酵母絮凝。

a. 當藍光不存在時，啟動子 C120-CYCp 不會(hui) 被激活產(chan) 生 TetR，從(cong) 而產(chan) 生 LacI 抑製lacO，核酸內(nei) 切酶不表達

b. 當紅光不存在時，pAND 不被激活，核酸內(nei) 切酶不表達

c. 隻有當藍光與(yu) 紅光都存在時，才會(hui) 啟動下遊轉錄

Results

該團隊原本計劃采用乳鐵蛋白作為(wei) 生物農(nong) 藥，但在分泌的檢測中，由於(yu) pGmLf-H 中未出現與(yu) 陽性對照組相同的 80kDa 條帶，說明乳鐵蛋白未成功合成和分泌。由於(yu) 時間的限製，該團隊選擇放棄乳鐵蛋白，采用HBD2。

采用新加坡合成生物初創公司Vaciome捐贈的用於(yu) 畢赤酵母的HBD2結構後，該團隊成功地使用釀酒酵母合成了HBD2。

使用mKO熒光蛋白檢測藍光調控係統的代謝功能。在藍光誘導下，實現了 mKO 的高表達。但在黑暗條件下，pC120-mKO-EL-U 仍然有大量表達，說明藍光誘導係統具有嚴(yan) 重的泄露表達。因此，該團隊決(jue) 定將基因定位於(yu) 基因組中，以減少泄漏的情況。

運用 Gibson 同源重組將基因整合到基因組上，減少泄露表達，並減少 EL222 二聚化。實驗證明了整合在基因組上的 EL222 基因能夠正常表達，且泄露表達減少到 50%。100%藍光和 50%藍光下 mKO 表達差異不大，說明係統對藍光敏感。

該團隊計劃通過增加啟動子結合位點的方式增加啟動子活性，但建模表明這種方式可能會(hui) 增加泄露。因此，他們(men) 設計了雙重抑製的係統來解決(jue) 這一問題。但實驗結果並不理想，在藍光誘導下的抑製現象並不明顯，需要進一步排查故障。

通過前饋係統增加藍光誘導係統對藍光的應答。實驗結果證明表達量增加到兩(liang) 倍而泄露量則沒有相應增加，pRL3CM-H 仍然表現出一定程度的泄露。

具有核酸內(nei) 切酶功能的BBa_K1159105被選為(wei) 理想的殺傷(shang) 開關(guan) ，因為(wei) 它不僅(jin) 可以防止活生物體(ti) 逃離生物反應器，還可以破壞修飾的DNA，減少水平基因轉移的機會(hui) 。

為(wei) 了提高核酸酶的功效，在該part的N末端添加了NLS序列，這有助於(yu) 定位到細胞核以消化基因組和DNA，增加細胞培養(yang) 物的死亡率。實驗結果證明死亡率增加。

由於(yu) 時間不足，未完成紅光轉錄因子的工程。

Model

對誘導藍光係統進行建模，以揭示其機理動力學特征。

利用擬合曲線來建議和探索藍光激活表達係統的可能改進。

建立了一個(ge) 兩(liang) 全其美的新絮凝模型：該模型不僅(jin) 計算成本低廉，而且僅(jin) 使用分光光度計即可通過OD測量進行驗證。

通過結合兩(liang) 個(ge) 常微分方程係統完成建模。

Human Practices

綜合人類實踐

1. 了解當地的害蟲問題

2. 定義(yi) 一個(ge) 好的解決(jue) 方案

3. 構思我們(men) 的解決(jue) 方案

4. 實施和評估

受白粉病影響的草莓

教育與(yu) 交流

與(yu) 南洋理工大學（NTU）iGEM合作組織了的麵向大學預科學生的研討會(hui) ，介紹合成生物學基礎知識和一些著名的行業(ye) 應用

製作了一個(ge) 消費者教育視頻，以傳(chuan) 播對生物農(nong) 藥的認識