BNUZH-北京師範大學珠海校區iGEM-2022項目簡介

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XMU-China 2023

課題：BNUZH-China

主要內(nei) 容：利用木醋杆菌(Acetobacter xylinum)構建細菌纖維素(BC)複合支架來輔助大麵積皮膚傷(shang) 口的愈合。

關(guan) 鍵詞：細菌纖維素、BC、傷(shang) 口修複、木醋杆菌

1.課題背景

創口的產(chan) 生和愈合伴隨著人們(men) 的一生。皮膚作為(wei) 人體(ti) 最大的器官，是人體(ti) 抵抗外界環境傷(shang) 害等的最重要屏障。日常生活中皮膚受損是很常見的，一般而言，隻損害表皮的微小的創口易於(yu) 愈合，但損害真皮層的深層創口往往需要很長的恢複時間。如燒傷(shang) 、手術、慢性疾病如糖尿病帶來的皮膚損傷(shang) ，通常都難以恢複，而且很容易發生細菌感染，然後轉化為(wei) 炎症、潰瘍，迫使患者需要進行截肢或其他的治療手段，最壞的情況下可能導致死亡。

而且，由於(yu) 社會(hui) 逐漸老齡化，慢性病致使嚴(yan) 重皮膚損傷(shang) 的案例與(yu) 日俱增。因此，加速創麵愈合，提高創麵愈合質量成為(wei) 現代醫學最具挑戰性和邊緣化的學科之一，而傷(shang) 口愈合和組織再生的研究成為(wei) 醫學研究者日益關(guan) 注的領域。考慮到目前大麵積深度創口主要使用皮膚移植、皮瓣移植等傳(chuan) 統方法存在的限製與(yu) 問題，課題組提出了一種利用細菌纖維素(BC)作為(wei) 真皮細胞生長支架，輔助傷(shang) 口愈合的方法。

2.課題原理

細菌纖維素，bacterial cellulose(以下簡稱 BC)，是一種由微生物合成的具有高純度，高持水性和強抗拉性的天然納米級纖維素，可以由不同種類的細菌產(chan) 生。其中，研究最廣泛的細菌是醋杆菌,尤其是木醋杆菌Acetobacter xylinum。

促進全層皮膚組織缺損再生的核心是真皮組織的再生。真皮組織缺損程度影響傷(shang) 口愈合過程。一旦真皮再生成功，皮膚移植中封閉傷(shang) 口所需的皮片厚度將大大減少(甚至不需要取自體(ti) 皮膚)，傷(shang) 口的愈合質量將進一步提高。因此，輔助真皮再生的支架材料近年來受到越來越多的關(guan) 注。

在真皮再生過程中，BC支架可以為(wei) 細胞生長增殖提供載體(ti) ，使細胞攀爬生長。這有助於(yu) 更好地控製細胞生長的方向和趨勢，為(wei) 傷(shang) 口組織的再生提供穩定的環境。值得一提的是，BC材料作為(wei) 真皮再生支架具有以下優(you) 點。首先，BC具有獨特的納米纖維網絡結構，支持細胞滲透和增殖。此外，BC具有高度的生物相容性，對參與(yu) 傷(shang) 口愈合的細胞如成纖維細胞和角質形成細胞沒有細胞毒性。此外，BC具有調節細胞粘附的潛力。體(ti) 外評價(jia) 表明，BC在促進細胞粘附、增殖和細胞轉移方麵具有優(you) 異的作用。

雖然BC作為(wei) 這種輔助真皮再生的支架，有非常多的優(you) 點，也有很廣闊的應用前景，但它也有一個(ge) 不可忽視的缺陷。由於(yu) 人體(ti) 中不能合成纖維素酶，這就導致已愈合傷(shang) 口中的BC支架不能自主降解，甚至會(hui) 一直留在人體(ti) 中，這就可能引發不必要的免疫反應。因此，課題組也在此項目中設計了一個(ge) 降解BC的係統，配合硬件，使這種BC支架更加安全，有更好的應用前景。

3. 項目設計

在此項目中，課題組設計了四個(ge) 模塊，各別發揮不同的功能，互相輔助完善。四個(ge) 模塊包括：基本的BC生產(chan) 模塊、促進愈合模塊、藍光激活的BC降解模塊、紅光激活的自殺模塊。接下來一一介紹這四個(ge) 模塊的詳細設計。

3.1BC生產(chan)

此模塊主要負責生產(chan) 真皮細胞支架BC。課題組選擇了具有優(you) 良BC生產(chan) 性能的木醋杆菌(Acetobacter xylinum)來生產(chan) BC，並在此基礎上進行了初步改造。木醋杆菌，別名葡糖醋杆菌，是一種革蘭(lan) 氏陰性菌。它嚴(yan) 格好氧，可以用於(yu) 釀造糖醋，也是發酵培養(yang) 紅茶菌的菌種。課題組選用木醋杆菌生產(chan) BC，主要是因為(wei) 這種細菌體(ti) 內(nei) 合成BC的路徑已被研究透徹，且往屆的BNDS_China 2020、TUST_China 2017等也使用這種菌成功合成了BC。更重要的是，據文獻記述，木醋杆菌中BC的產(chan) 量比其他普通的細菌高出很多倍，同時該BC的物理性質也非常良好。

為(wei) 了進一步修飾BC，使其在幫助傷(shang) 口愈合上發揮更好的效果，課題組考慮在BC膜的修飾中加入殼聚糖、透明質酸等小分子物質進行初步修飾交聯。其中，殼聚糖(chitosan)具有優(you) 良的生物相容性、生物降解性、抗菌能力和促進傷(shang) 口愈合的能力。是生物醫用材料，尤其是組織再生材料的理想原料。透明質酸(hyaluronic acid)是細胞外基質的重要組成部分，在細胞信號傳(chuan) 遞和傷(shang) 口愈合中起著重要作用。預計修飾後，BC膜的保水性、韌性等物理和機械性質都有顯著性提升。

圖 1 木醋杆菌生產(chan) BC膜修飾示意圖

3.2 促進愈合

BC膜和小分子修飾物(殼聚糖，透明質酸)的存在下能夠幫助真皮細胞的黏附及增長，因此間接地來說，BC在一定程度上有幫助傷(shang) 口愈合的功能。但課題組希望通過其他方式，間接修飾皮膚傷(shang) 口中的細胞，以增強皮膚細胞的增殖和抗菌能力，縮短傷(shang) 口愈合的時間。此模塊旨在提高係統的抗菌能力，促進傷(shang) 口愈合功能。在提升抗菌性能方麵，課題組選擇使用抗菌肽LL-37。而促進傷(shang) 口愈合方麵，課題組設計通過表達堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，以下簡稱bFGF)和表皮生長因子(Epidermal growth factor，以下簡稱EGF)來實現這一功能。

3.2.1抗菌肽LL-37

抗菌方麵，課題組選擇抗菌肽LL-37，而不直接使用抗生素的原因是顧慮抗生素易產(chan) 生耐藥性等諸多副作用。而LL-37是哺乳動物中經過充分研究、最有前途和安全的抗菌肽之一。它具有廣泛的抗菌譜，如革蘭(lan) 氏陽性和革蘭(lan) 氏陰性細菌、病毒、真菌、寄生蟲。這樣看來，需要長期並廣泛使用，LL-37抗菌肽似乎有更好的前景。

3.2.2bFGF與(yu) EGF

傷(shang) 口愈合的整個(ge) 過程主要受生長因子的調控。在此過程中，外源性補充生長因子或提高內(nei) 源性生長因子的活性均能促進傷(shang) 口愈合。

堿性成纖維細胞生長因子(bfGF)具有廣泛的促有絲(si) 分裂和細胞存活活性，並參與(yu) 多種生物過程，包括胚胎發育、細胞生長、形態發生、組織修複、腫瘤生長和侵襲。它能夠作用於(yu) 全層皮膚細胞，調節細胞外基質成分的合成和沉積，增加角質形成細胞的遷移，促進成纖維細胞的遷移，從(cong) 而加速肉芽組織的形成和再上皮化。攝入外源性bFGF還可增加創麵VEGF、TGF-β等細胞因子的表達，從(cong) 而促進血管內(nei) 皮細胞的有絲(si) 分裂，增加內(nei) 皮通透性，進一步促進毛細血管融合和大血管生成。

表皮生長因子(EGF)能促進表皮增殖和角化，上皮細胞分裂和增強細胞活性，促進皮膚和粘膜創麵愈合。

3.2.3 具體(ti) 實現方式

要使皮膚創麵的細胞快速高效地分泌LL-37，EGF和bFGF，構建腺相關(guan) 病毒(adeno associated virus, 以下簡稱AAV)是最有效的形式。因此，課題組計劃使用AAV作為(wei) 三種功能肽的載體(ti) 。通過在傷(shang) 口源下注射修飾的AAV，接觸並侵入人體(ti) 傷(shang) 口的細胞，然後將目的基因轉移到細胞內(nei) ，使傷(shang) 口內(nei) 的成纖維細胞和其他細胞能夠獨立表達功能性多肽，實現促進愈合的作用。

圖2 表達抗菌肽LL-37的基因回路(左)及其抗菌示意圖(右)

圖3 表達EGF的基因回路(左)及其促進愈合示意圖(右)

圖4表達bFGF的基因回路(左)及其促進愈合示意圖(右)

3.3藍光激活BC降解

此模塊旨在啟動工程化成纖維細胞ATCC CRL-2522(BJ)在藍光下的纖維素酶分泌和表達，從(cong) 而降解皮下無功能的纖維素支架為(wei) 葡萄糖，同時防止疤痕和可能的免疫反應。這是通過引入藍光激活的LightOn基因表達係統來實現的。後續通過慢病毒作為(wei) 載體(ti) ，感染不同的成纖維細胞，使這些成纖維細胞在藍光的誘導下分泌表達相應的纖維素酶，分解BC。

LightOn係統是一個(ge) 質粒係統，它使用組成型啟動子CMV，負責啟動表達單一的光敏轉錄因子GAVPO，在黑暗條件下不與(yu) 目標轉錄單元結合，則目標基因不能表達。當右藍光照射後，GAVPO會(hui) 二聚化與(yu) 目標轉錄單元的UASG序列結合，激活目標基因的表達。

LightOn係統誘導的三種細菌纖維素酶基因均來自Cellulomonas fimi，課題組將這三個(ge) 基因拆分後，分別構建回路然後放到病毒中。上述基因個(ge) 別功能如下

由於(yu) 上述所有三個(ge) 基因都是原核表達基因，因此課題組又設計了真核信號肽IL2-sig(人類白細胞介素2的信號肽，signal peptide of Homosapiens interleukin 2)在其C末端的融合，以使其能夠在工程BJ中分泌表達。

圖5 藍光誘導的BC降解係統回路設計

3.4紅光激活自殺

當BC完全降解後，為(wei) 了防止工程BJ繼續分泌纖維素酶而引起不必要的免疫反應，課題組設計了紅光調控係統REDMAP來控製下遊毒素蛋白MazF的表達。

MazF是一種大腸杆菌毒素。MazF被誘導後，可在單鏈RNA的ACA位點的第一個(ge) A和C之間產(chan) 生特異性切割反應，從(cong) 而有效抑製蛋白質合成。MazF還對哺乳動物的正常細胞和腫瘤細胞具有殺傷(shang) 作用。在紅光(660 nm)照射下，工程化成纖維細胞會(hui) 合成MazF毒素，幹擾自身蛋白質的正常合成，從(cong) 而引發一係列反應，最終導致自身凋亡。這些細胞的凋亡機製將在遠紅光照射(730 nm)下終止。

紅光/遠紅光自殺控製係統REDMAP對光非常敏感，它可以感應到低至0.1 mW cm^-2的紅光(遠紅光)。該係統的具體(ti) 機製是：當係統暴露於(yu) 紅光 (660 nm)時，反式激活因子(FHY1-VP64)可以在光敏色素藻藍膽素(PCB)存在的情況下特異性結合光傳(chuan) 感器結構域(ΔPhyA-Gal4)，同時結合的蛋白質複合物易位到細胞核中，然後與(yu) 其合成啟動子結合(P5×UAS，5×UAS-PhCMVmin)，最終啟動MazF的表達。另一方麵，當係統暴露於(yu) 遠紅光(730nm)後，反式激活因子從(cong) 光傳(chuan) 感器域(ΔPhyA–Gal4)解離，從(cong) 而終止MazF的表達。同時，為(wei) 了防止CMV強啟動子直接激活MazF的表達，課題組將MazF區域調整到CMV啟動子的上遊。

圖6 紅光自殺係統回路設計

4. 硬件設計

通過我們(men) 的數據搜索和對Human Practice中對醫生的采訪，課題組發現協助傷(shang) 口愈合的方法必須結合傷(shang) 口清創。同時，也需要保護傷(shang) 口，防止空氣中的細菌對其進一步感染。因此為(wei) 了解決(jue) 上述問題，課題組設計了一種便攜、遮光、可拆卸、可生物降解等特點的硬件。同時，這個(ge) 硬件還可及時監測患者傷(shang) 口情況，及時處理突發情況，確保治療有效。

硬件中包括三大部分，聚乳酸(PLA)外殼、攝像頭、印刷電路板。課題組設計的攝像頭是為(wei) 了能夠在不打開保護套的情況下，通過與(yu) 手機app相連，使患者或醫護人員可以隨時觀察傷(shang) 口情況，若發現情況不佳可隨時打開保護套，進行相應的治療。另外，印刷電路板上包含了三種顏色的LED燈：黃色、紅色、藍色。紅色光負責誘導誘導自殺；藍色光負責誘導BC的降解；而黃色光則負責照明，提供一定的亮度，使攝像頭拍攝的畫麵更便於(yu) 觀察。攝像頭，LED等的開關(guan) ，都是可以通過手機app調控的。

b.外殼外麵增加遮光的袖套