2022 CAU-China
1、Background
石質文物以石頭為(wei) 原材料。這些文物常常被放置在室外，被自然環境中的酸雨、鹽腐蝕，也遭受惡劣天氣的影響，石質文物上的結構和圖像可能會(hui) 隨著時間的流逝而消失。根據浙江大學張炳建教授及其團隊的研究結果，由一水合草酸鈣(calcium oxalate monohydrate,COM)構成的生物組織在保護石雕不被腐蝕方麵發揮著重要作用。
然而，人工生產(chan) 的草酸鈣並不能取得很好的效果。同時，真菌產(chan) 生的草酸鈣保護膜也是無效的，因為(wei) 真菌可能對雕像產(chan) 生不良影響。因此，中國農(nong) 業(ye) 大學的團隊希望通過對熒光假單胞菌2P24(Pseudomonas fluorescens 2P24)進行改造，該細菌在生產(chan) 外聚糖（extracellular polymeric substances，EPS）方麵有很好的能力。對熒光假單胞菌進行工程化處理，使其在石質文物的表麵產(chan) 生緊密的COM保護膜，從(cong) 而解決(jue) 這一問題。
細菌可以分泌EPS，促進周圍無機鹽的形成和結晶，產(chan) 生更穩定和更堅固的草酸鈣晶體(ti) 。基於(yu) 以上機製，CAU團隊設計了一種熒光假單胞菌去分泌EPS和草酸，讓遺跡表麵可以產(chan) 生一水合草酸鈣保護層來抵抗外界腐蝕。
2、Design
他們(men) 的總體(ti) 目標可以分為(wei) 三個(ge) 。
第一，將EPS的相關(guan) 調節因子轉移到細菌中，使相關(guan) 基因過度表達。
第二，將調控草酸鹽合成酶和流出通道的基因轉移到細菌中。
第三， 利用乳糖操縱子和光調節係統分別調節EPS的生產(chan) 和草酸鹽的分泌。
1.提高EPS產(chan) 量
團隊通過增強cdg與(yu) gacA兩(liang) 個(ge) 基因的拷貝數，使得細菌中的EPS的產(chan) 量提高，從(cong) 而增強細菌生物膜的產(chan) 生，提高後續草酸鹽與(yu) 產(chan) 生與(yu) 排出時的優(you) 勢。
圖1 生產(chan) EPS的表達通路
2.利用藍光係統調節草酸鹽的合成
團隊采用藍光調節係統來控製細菌產(chan) 生與(yu) 外排草酸鹽的時間準確度。藍光調節係統中的啟動子Pfixk2在黑暗條件下可以誘導下遊基因表達，並在受到光照時停止表達。這樣的設計可以緩解細菌在非應用狀態時的生存壓力。
該團隊轉入obcA與(yu) obcB兩(liang) 個(ge) 基因，改變了細菌體(ti) 內(nei) TCA循環回路，使得細菌能夠產(chan) 生草酸鹽。下調oxdC與(yu) gltA，減少草酸的降解和抑製草酰乙酸生成檸檬酸，增加草酸鹽的產(chan) 生。FpOAR作為(wei) 草酸鹽外排蛋白，幫助草酸鹽外排至細胞外環境中。
圖2 草酸鹽合成外排的表達通路
圖3 草酸鹽合成與(yu) 外排的表達通路
3.自殺開關(guan) 的設計
該遺傳(chuan) 回路是通過將兩(liang) 個(ge) 蘇氨酸啟動子（PcysJ和PcysH）與(yu) 毒素基因mazF和抗毒素基因mazE相結合。PcysJ和PcysH可以特異性地響應高蘇氨酸濃度，激活下遊基因表達，而同時使用兩(liang) 個(ge) 啟動子是為(wei) 了更好地調控後麵兩(liang) 個(ge) 基因的表達。mazF的表達產(chan) 物可以特異性剪接遊離mRNA，抑製細菌生長。而抗毒素基因mazE的表達產(chan) 物可以抑製mazF基因的作用。
在高蘇氨酸濃度的條件下，這兩(liang) 個(ge) 基因會(hui) 不斷表達，MazE抑製MazF的作用，細菌可正常生長。在低蘇氨酸濃度的條件下，它們(men) 的表達會(hui) 降低，MazE的快速降解導致MazF的作用無法被抑製，因此造成細菌死亡。
圖4 自殺開關(guan) 的表達通路
3、Results
1.生物膜的增強
團隊采用結晶紫染色法檢測生物膜產(chan) 生的程度。通過轉入單個(ge) 基因和同時轉入兩(liang) 個(ge) 基因分別對生物膜的產(chan) 生進行調節，然後通過結晶紫染色法來測定不同細菌產(chan) 生的生物膜量的比較。通過實驗結果可以看出，當同時轉入兩(liang) 個(ge) 基因進去的時候，該細菌的生物膜產(chan) 量較其他幾組是有顯著增加的。同時，他們(men) 也在不同的條件下測定細菌產(chan) 生生物膜的能力，通過實驗發現，在０.０１M鈣離子濃度，培養(yang) ２８小時的條件下，生物膜的產(chan) 量最高。
圖5 在96孔板中進行結晶紫染色，排除位置對結晶效果的影響
圖6 使用熒光單胞菌最終的測試結果（0.01 M Ca2+，0.5 M IPTG，28 h）
2.測試草酸合成能力和細菌對草酸的耐受能力
團隊先對比工程菌與(yu) 野生型細菌在梯度草酸濃度下的生存情況，結果表明工程菌在高濃度的草酸下生存情況較好。然後團隊通過水楊酸絡合鐵比色法測定兩(liang) 種菌細胞內(nei) 外草酸濃度，再對測定的濃度進行方差分析（Duncan方法）。結果表明，團隊添加的Plac提高了草酸的外排效率，達到預期的實驗結果。
圖7 熒光假單胞菌在不同濃度草酸上的生長情況 A：實驗組（導入質粒的熒光假單胞菌）B:對照組（野生型菌株）
由該圖可知，實驗組在０－１０ｍＭ的草酸鹽濃度下生長狀況並沒有差異，而對照組在濃度較高的草酸濃度下，細菌明顯生長狀況下降。
圖8 細菌內(nei) 外草酸濃度測量結果
他們(men) 同時構建了一個(ge) 啟動子與(yu) 兩(liang) 個(ge) 啟動子的遺傳(chuan) 回路，對細菌的內(nei) 外草酸濃度進行比較，圖中2nd代表的是一個(ge) 啟動子的線路表達出來的結果，3rd是兩(liang) 個(ge) 啟動子的線路表達出來的結果。根據對比內(nei) 外草酸濃度，可以得到Plac的添加提高了草酸的流出效率。
3.藍光控製係統的檢測
引入了YF1N37C突變體(ti) 進入線路中，提高對藍光係統的應答能力和調節基因的表達YF1蛋白37號位置上將Asn突變成Cys可以提高光控製係統調節基因表達的能力。他們(men) 通過設計具有突變的引物，用了DpnI選擇產(chan) 品的線性化突變體(ti) 。對生長在含有Amp的培養(yang) 基上的單克隆菌落進行了菌P和測序，生成了yf1的單克隆突變。
團隊采用mCherry作為(wei) 標記基因來測試光控製係統。在培養(yang) 細菌並誘導，離心後在藍光下觀察（mCherry可以被激發產(chan) 生紅色熒光），4 h和11 h收獲細菌，未檢測到明顯的熒光。SDS-PAGE結果中沒有觀察到mCherry的條帶。推測可能由於(yu) 啟動子強度不夠，導致未觀察到相關(guan) 現象。
圖9 SDS-PAGE對mCherry的檢驗
4.自殺係統的驗證
驗證自殺係統的可行性是使用的大腸杆菌。讓導入質粒的大腸杆菌和野生型大腸杆菌分別在普通LB中和含有25 g/L蘇氨酸的LB中過夜培養(yang) ，然後把它們(men) 再分別轉移到蘇氨酸培養(yang) 基和普通LB培養(yang) 基中，十八個(ge) 小時以後分別測量他們(men) 的OD值，檢測細菌生長情況。理論上，隻有從(cong) 蘇氨酸培養(yang) 基進入LB培養(yang) 基的細菌會(hui) 死，但是實驗結果表明，這個(ge) 係統好像對大腸杆菌沒有影響。
圖10 對大腸杆菌數目的測定結果（JEF為(wei) 導入質粒的實驗組）
可能是線路中使用的RBS來源於(yu) 熒光假單胞菌，在大腸杆菌係統中不表達。野生型的菌株轉移到蘇氨酸上的實驗組中菌落數目比較少，可能是因為(wei) 高濃度蘇氨酸會(hui) 抑製細菌的生長。
選用熒光假單胞菌作為(wei) 底盤重新進行實驗，但是熒光假單胞菌在培養(yang) 基上的生長不太穩定，就沒有使用OD600的值來表示菌落數目，而是選用的菌落計數。
圖11 熒光假單胞菌在不同培養(yang) 基上培養(yang) 的結果
圖12 熒光假單胞菌數目的測定
從(cong) 圖中可以看出最後結果未達預期，該團隊認為(wei) 是大腸杆菌的啟動子在工程菌中無法正常表達導致的。經過與(yu) ZJU- China的商議，他們(men) 認為(wei) 可能是大腸杆菌的啟動子在不同生長周期的活性不同導致的，也可能與(yu) 毒素抗毒素濃度不匹配有關(guan) 。除此之外，但是毒素抗毒素係統仍然有86%的抑製效率。
4. BIMP（細菌誘導的礦物沉澱）的結果
圖13 200倍放大掃描石灰石的結果 A：LB對照組 B：化學礦化組 C：空白對照組 D：BIMP處理組
實驗結果表明，A、C組沒有明顯區別，黑色石灰石表麵都產(chan) 生了白色雜質，B、C組形成了白色膜薄，但是化學礦化組不能覆蓋石灰石表麵的小的圓形凹陷，生物組則可以覆蓋小的凹陷。BIMP與(yu) 化學礦化的比較中，化學礦化對於(yu) 石材一些細節方麵的結晶效果並不如BIPM好，且晶型也較為(wei) 鬆散。
圖14 石灰石表麵白色部分的占比
團隊對結晶表麵所占的百分比進行了統計，結果中化學礦化的效果是要更好一些的，但BIMP的產(chan) 率更為(wei) 穩定，團隊希望再後續實驗中進一步加強生物膜的產(chan) 生，以增加COM的麵積覆蓋程度。
4、HP
在HP方麵，團隊與(yu) 從(cong) 事文物研究的方麵的研究員，從(cong) 事文物保護方麵的博士等專(zhuan) 家都進行了相關(guan) 的對話與(yu) 討論，明確在微生物保護文物方麵的相關(guan) 需求與(yu) 要注意的事項，為(wei) 實驗部分提供相應的指導。團隊還從(cong) 官方，研究者，文物保護工作者等多方麵角度，調查它們(men) 對於(yu) 利用微生物保護文物的不同的態度與(yu) 看法，兩(liang) 方麵的意見都有，使團隊更加深刻以及深入的了解到微生物保護文物的可行性。
5、Hardware
在硬件方麵，團隊打造一套相應的裝置，以套件的形式展示產(chan) 品。該套件使用簡單，適合批量生產(chan) 。主要包括刷子、噴霧瓶、PVA膜、遮陽布、IPTG（0.5M）、蘇氨酸和生物膜草酸生長液。
圖15 受到環境影響的石質文物
6、Software
在模擬生物膜的過程中，團隊發現生物膜中的滲透會(hui) 形成營養(yang) 濃度的梯度。因此，生物膜的生產(chan) 效率和細菌的分裂率與(yu) 其所在位置的營養(yang) 濃度有關(guan) ，在生物膜中是不同的。為(wei) 了解決(jue) 這個(ge) 問題，團隊建立了一個(ge) 模型來預測基於(yu) 泊鬆方程和莫諾方程的固體(ti) 基質中的營養(yang) 濃度。意識到iGEMer將來可能會(hui) 遇到類似的問題，通過FEniCSX（一個(ge) 優(you) 秀的有限元平台）製作了一個(ge) 基於(yu) 他們(men) 模型的軟件工具。此外，為(wei) 了方便那些不擅長編程的用戶，團隊為(wei) 他們(men) 設計了一個(ge) 圖形用戶界麵（GUI）。
7、Model
為(wei) 了更深入地了解項目內(nei) 各環節作用機理，對複雜係統做出適當的預測，為(wei) 濕實驗提供反饋和建議，團隊建立了一係列數學模型，包括生長曲線模型、草酸鹽產(chan) 生與(yu) 分泌模型、殺傷(shang) 開關(guan) 模型、生物膜生長模型、 COM的防腐機理模型和石材風化模型。
圖16 受到腐蝕影響的石質文物
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