2016 Imperial_College iGEM課題分享

2023 iGEMiGEM課題分享

2016  Imperial_College ecolibrium

Achievements：Grand Prize Winner Undergraduate,

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Part.01項目背景Background

自然界中，不同種微生物生活在同一個(ge) 生態環境中，單獨隔絕的微生物種群是不存在的。不同種微生物之間也存在信息交流與(yu) 能量利用，這對微生物群的生長調控至關(guan) 重要，同時也有利於(yu) 最大化利用環境資源。

而實驗室在一體(ti) 係中定量培養(yang) 多種微生物是很困難的。因為(wei) 不同微生物最佳生長條件有差異，在共培養(yang) 體(ti) 係中微生物培養(yang) 條件難以確定，且更加困難的是做到精確調控不同種微生物群之間的期望比例。

Imperial_College想針對共培養(yang) 技術所遇到問題，設計一個(ge) 可精確調控菌群比例的共培養(yang) 係統。

Part.02課題設計design

  團隊設計了三個(ge) 模塊以構建可調控的共培養(yang) 係統，分別是通信模塊、比較模塊、生長調節模塊。

  除了基因線路，Imperial_College還設計了A.L.I.C.E.軟件,幫助研究者確定共培養(yang) 條件。

1.通信模塊

  通信模塊利用兩(liang) 個(ge) 正交的群體(ti) 感應係統，使我們(men) 的大腸杆菌種群能夠檢測自己的種群密度以及其他種群的種群密度。

  為(wei) 了允許在電路中使用不同的群體(ti) 感應係統，我們(men) 選擇使用四種可能的係統：Las，Rhl，Lux和Cin，分別被30-C12AHL、C4AHL、30-C6AHL、30-C14AHL群體(ti) 感應調節因子所激活誘導。

圖1 四種群體(ti) 感應蛋白及相關(guan) 的AHL

2.比較器模塊

比較器模塊將群體(ti) 感應信號連接到細胞內(nei) RNA邏輯，以便細菌可以將自己的群體(ti) 與(yu) 其他細胞係的群體(ti) 進行比較。

圖2 比較器模塊SATAR設計原理圖

本模塊核心設計應用了small transcription activating RNAs（STAR）調控係統。在細胞內(nei) ，目標基因上遊存在發卡結構終止子pAD1結合於(yu) 上遊啟動子區域，遏製RNA聚合酶的結合，而當STAR存在時，STAR可與(yu) 發卡結構終止子pAD1互補配對，解除抑製作用，結果來看，激活了目標基因的轉錄。

本課題在STAR序列上遊放置群體(ti) 調節啟動子pQS1，在Anti-STAR（一段可以與(yu) STAR結合配對RNA序列編碼基因）上遊放置群體(ti) 調節啟動子pQS2，STAR轉錄量均取決(jue) 於(yu) 群體(ti) 感應分子濃度，成正比例關(guan) 係。

如果兩(liang) 個(ge) 細菌群體(ti) 大小相同的情況下，群體(ti) 調節因子誘導的STAR和Anti-STAR量相等，相互結合，則沒有多餘(yu) 的STAR作用於(yu) pAD1，不會(hui) 激活生長調節蛋白（抑製生長蛋白）的轉錄，兩(liang) 個(ge) 細菌群體(ti) 處於(yu) 正常生長狀態。如果群體(ti) 數量不相等，群體(ti) 規模更大的細胞群分泌更多群體(ti) 調節因子，作用於(yu) 基因層麵會(hui) 轉錄生成更多STAR序列，STAR數量>Anti-STAR，STAR可以發揮解除pAD1抑製的作用，從(cong) 而激活下遊基因轉錄。

3.生長調節模塊

前文所提到的利用STAR係統調控的下遊目的基因，作用是要可抑製菌群生長。團隊選用的生長抑製蛋白基因有兩(liang) 種：Gp2 ，T7噬菌體(ti) 基因，抑製減緩細胞生長，可逆性與(yu) E.coli RNA聚合酶結合；Gp0.4，T7噬菌體(ti) 基因，有絲(si) 分裂末時（母細胞分裂成兩(liang) 子細胞時）與(yu) FtsZ環結合，延緩細胞生長。

優(you) 點：快速、可逆、高效。

（1）基因片段小，轉導快；

（2）Gp2表達後蛋白直接作用於(yu) 聚合酶，起到抑製作用，無需多級調控，線路反應迅速；

（3）相較於(yu) LeuB營養(yang) 缺陷型細胞難製作，成本高的特點，表達Gp2不需過多流程和成本；

（4）避免抗生素耐藥問題；

（5）普通培養(yang) 基培養(yang) 即可。

圖3 基因線路設計圖

4.A.L.I.C.E.

Imperial_College針對共培養(yang) 體(ti) 係條件難確定的問題，設計了A.L.I.C.E.，一個(ge) 可用於(yu) 指導菌株共培養(yang) 條件與(yu) 實驗方法的數據庫軟件。

Part.03課題結果

results

Part 1: 通訊模塊

實驗1：檢查不同群體(ti) 感應係統間是否會(hui) 產(chan) 生串擾

分別將Las, Rhl, Cin, Lux四種群體(ti) 感應係統彼此之間進行正交性測定（即檢查相互之間是否會(hui) 產(chan) 生信號幹擾）。由於(yu) 時間原因，該隊伍隻來得及做了Las和Rhl的正交性測定。

方法：

構建如下圖所示的質粒並轉入：

圖1 質粒表征結構設計，其中Response 代表群體(ti) 感應係統對應的轉錄激活因子，pQ為(wei) 群體(ti) 啟動子

實驗將轉入了不同轉錄激活因子的質粒的細菌培養(yang) 到指數增長階段之後轉移到96孔板中並在180分鍾後監測熒光信號和吸光度值，計算單個(ge) 細胞的歸一化熒光度值。

結果

對於(yu) Rhl係統：

其自身的C4 AHL激活其轉錄激活因子所需的濃度約為(wei) 100nM-100uM，且檢驗表明Rhl會(hui) 與(yu) Lux高度串擾，與(yu) Las輕微串擾，而與(yu) CinR幾乎無串擾。

對於(yu) Las係統：

其自身的C12 AHL激活其轉錄激活因子所需的濃度約為(wei) 100pM-10uM，且檢驗表明Las會(hui) 與(yu) Cin高度串擾，與(yu) Lux和Rhl均幾乎無串擾。

綜上所述，Rhl與(yu) Las正交性較高，能夠作為(wei) 一組正交群體(ti) 感應係統在實驗中發揮作用。

Part 2：比較器模塊

實驗2：STAR係統的功能驗證實驗

STAR係統能夠結合目標基因上遊的pAD1質粒衰減子序列，即本實驗中的生長抑製基因。pAD1 質粒衰減子序列能夠形成一個(ge) RNA發夾結構阻止 RNA 聚合酶轉錄基因，充當轉錄終止子。STAR會(hui) 與(yu) 該發夾序列結合並幹擾其形成，從(cong) 而允許下遊基因的轉錄。

方法：

為(wei) 了驗證其功能，設計了兩(liang) 個(ge) 質粒：

1.基本STAR質粒

圖4 基本STAR質粒示意圖

存在該質粒的細胞中有STAR RNA存在，能夠解除pAD1的抑製並轉錄其下遊基因。

2.報告質粒

圖5 報告質粒示意圖

若存在此質粒的細胞中有STAR RNA的存在，則sfGFP的表達限製將被解除，能夠發出綠色熒光。

首先，為(wei) 了確定STAR能夠在多大程度上激活 sfGFP 轉錄，在 200 分鍾內(nei) 連續記錄 sfGFP 在同時具有兩(liang) 種質粒的細胞中的熒光，以及在僅(jin) 具有報告質粒的細胞中的熒光。

之後，為(wei) 研究STAR係統在不同溫度下的功能，分別在30℃和37℃條件下分別將同時具有兩(liang) 種質粒的細胞以及僅(jin) 具有報告質粒的細胞培養(yang) 5小時並測定其OD600 = 0.4條件下的熒光值。

結果

圖6 熒光度測定值示意圖

A中表示在200分鍾內(nei) ，雙質粒組的總熒光度穩定上升；B中表示100分鍾時存在STAR的質粒組歸一化熒光度遠高於(yu) 單報告質粒組，這表明 STAR 成功地阻止了 pAD1 質粒衰減器幹擾 sfGFP 轉錄。

圖7 30℃條件下的細胞培養(yang) 熒光測定

圖8 37℃條件下的細胞培養(yang) 熒光測定

用 STAR 係統可獲得的激活 sfGFP 表達要大得多，表明在不同的培養(yang) 條件下使用STAR係統的效果也不同。

Part 3. 生長調節模塊

實驗3：生長抑製蛋白Gp2能否有效抑製菌群生長及其可逆性驗證

方法：實驗將Gp2基因置於(yu) 阿拉伯糖操縱子下調控表達，在用阿拉伯糖誘導和停止誘導情況下，觀察Gp2表達，以及對於(yu) 菌群生長抑製效果。

圖9 阿拉伯糖誘導Gp2表達質粒構建

知識補充—阿拉伯糖操縱子

圖10 阿拉伯糖操縱子原理示意圖（圖源百度百科）

當Glu和Ara都存在時，araC本底轉錄，產(chan) 生少量的araC蛋白，結合於(yu) araO₁（-106~-144）,使RNA聚合酶不能結合araP_C，使araC的轉錄受到阻遏。

當有Ara存在，而沒有Glu時，Ara可作為(wei) 糖源。此時Ara和少量的araC蛋白結合形成了誘導型的araC蛋白,它作為(wei) 正調控因子結合於(yu) araI，促進了araP_BAD的轉錄，產(chan) 生了3種酶，促使Ara分解；

當Ara不存在或者用過完了，過量的araC蛋白可以結合則araO₁上，阻礙RNA聚合酶在此區域結合，從(cong) 而關(guan) 閉了操縱子；或者結合到araI（-40~-78）和araO₂上，彼此相互作用形成了環，阻遏了P_BAD和P_C的啟動。

結果

圖11 AeaBAD-GFP/pSB1A2熒光強度表達

左圖，37℃，不同濃度阿拉伯糖誘導細菌，熒光強度隨時間變化，10 mM阿拉伯糖誘導熒光強度最強。右圖，熒光強度隨阿拉伯糖濃度誘導變化，表明阿拉伯糖濃度與(yu) 熒光強度呈現正相關(guan) 。

圖12 不同濃度阿拉伯糖誘導下菌群隨時間生長情況

將Gp2置於(yu) ara操縱子下調控，誘導後細菌生長情況。結果可見，10 mM ara誘導後，對菌群生長抑製效果最好。

圖13 停止阿拉伯糖誘導後菌群隨時間生長情況

葡萄糖誘導，以關(guan) 閉阿拉伯糖操縱子。結果顯示，菌群生長曲線呈現明顯上升趨勢，表明菌群自大約250 min開始菌群生長恢複。

Part.04社會(hui) 實踐human practices

在Imperial College 的項目中，運用了社會(hui) 技術整合協議（STIR），這意味著考慮項目的倫(lun) 理、社會(hui) 、法律或環境維度，並將這些維度納入項目工作。通常，iGEM基礎研究賽道的隊伍隻會(hui) 與(yu) 其他科學家溝通工作；通過STIR這種方式反思實驗室的日常決(jue) 策，反思對現實世界的應用能力，通常能夠讓社會(hui) 問題得到更優(you) 的解決(jue) 方案。