文獻分享：Synthetic Biology Within the Operon Model and Beyond（2）

Reading

文獻分享——Designing Biological Circuits: Synthetic Biology Within the Operon Model and Beyond （2）

在這篇綜述中，作者研究了Jacob和Monod提出的操縱子模型如何為(wei) 第一代合成基因線路的構建奠定基礎，並用微生物合成生物學的一係列例子來說明最廣泛的合成基因調控策略與(yu) 幾十年前Jacob和Monod的預測之間驚人的相似性。

01、介紹

The first part

在1961年發表的一係列具有裏程碑意義(yi) 的論文中，Jacob和Monod將當代關(guan) 於(yu) 基因結構及其表達模式的發現整合為(wei) 一個(ge) 全麵而深遠的基因調控理論:操縱子模型(operon model)[1]。這個(ge) 框架來自於(yu) 他們(men) 自己在乳糖存在下培養(yang) 的大腸杆菌中誘導β-半乳糖苷酶活性的工作，以及其他幾項關(guan) 於(yu) 適應性酶和λ噬菌體(ti) 的研究。為(wei) 了解釋代謝適應和分化現象，Jacob和Monod提出了模型遺傳(chuan) 回路的藍圖。這些網絡由三類遺傳(chuan) 元件組成:調控基因(如 lacI)，它們(men) 的目標操作符(如 lacZYAo)和結構基因(如 lacZ)。

操縱子模型提出了幾個(ge) 可驗證的預測，包括以下內(nei) 容: (a) 類似的機製可能在生命的各個(ge) 領域都是保守的; (b) 元件是模塊化的，這意味著操作符和調節器可以與(yu) 下遊操作符分離; (c) 這些元件可以組成具有複雜突現行為(wei) 的基因調控網絡。經過幾十年的研究，自然基因調控網絡的這些特征得到了完善，為(wei) 合成生物學領域提供了基礎和靈感。

02、操縱子模型中的合成生物學

The second part

在本節中，作者討論了操縱子模型及其更廣泛的理論框架對合成生物學早期研究的廣泛影響。首先強調早期合成基因回路與(yu) Jacob和Monod提出的圖表之間的驚人相似性。我們(men) 討論了轉錄調控策略的擴展，以涵蓋操縱子模型中允許的全部行為(wei) ，並注意到轉錄回路仍然是合成生物學中細胞重編程的主要模式。沿著中心法則，接著強調了Jacob和Monod提出的用於(yu) 轉錄後調控的替代細胞質操作符模型與(yu) 開發和實施基於(yu) RNA的工具構建合成電路之間的相似之處。

I：DNA 操縱子模型：調節基因表達產(chan) 物調控下遊操縱子序列，從(cong) 而控製其下遊基因表達，通過負控誘導的方式，即抑製蛋白在誘導物的作用下解除對於(yu) 操縱子的抑製作用。

II：轉錄水平級聯調控：LacI 在 IPTG 誘導下解除對 tetR的抑製，開啟其表達，tetR 在 aTc 的誘導下解除對於(yu) YFP 的抑製，開啟其表達。其中，組成型表達的 RFP 用於(yu) 測量該係統的外源噪聲。

III：自設計邏輯電路：NOR 邏輯門，在 aTc 和 IPTG 的單一誘導下可開啟 srpR 或 phlF 蛋白表達從(cong) 而抑製下遊 YFP 的轉錄。

I：RNA 水平的操縱子模型：類似於(yu) DNA 水平的操縱子，不過是在 mRNA 水平上進行調控。

II：配體(ti) 調控的核糖開關(guan) ：在無茶堿配體(ti) 的誘導下，核糖操縱序列會(hui) 發生自身配對，無法結合到 mRNA 上。在有茶堿配體(ti) 誘導的情況下，該序列構象改變，使其與(yu) 自身配對的一部分暴露，並且與(yu) mRNA 片段頭部的特定部位結合，阻止 GFP 蛋白質的合成。

III：Toehold 抑製子“Toehold Switch”合成的 Toehold 阻遏子是一個(ge) 操作序列，並且在匹配的 RNA 分子雜交時隔離 RBS，該 RNA 分子充當調節子，即 RNA 分子與(yu) Toehold 阻遏子配對結合的時候會(hui) 改變其莖環結構，使得 RBS 位點被遮蔽使得核糖體(ti) 無法結合表達。

03、操縱子模型以外的合成生物學

The third part

在本節中，作者探討了最近生命科學領域的基本進展如何為(wei) 合成生物學家提供了采用新工具編程複雜表型的機會(hui) 。首先強調在過去的二十年中，可編程的DNA和RNA結合分子如何介導了設計轉錄和轉錄後電路和調控器的方式的根本轉變。然後，作者將重點放在植根於(yu) 當代遺傳(chuan) 調控模型的合成驅動策略上，包括表觀遺傳(chuan) 學和遠程DNA相互作用。最後，作者討論了合成生物電路組裝中日益強調的翻譯後調控策略。

a：可編程核酸控製器：每個(ge) 鋅指蛋白結構域可以特異性識別結合 4 個(ge) 堿基對長度的 DNA 片段，因而多聚鋅指蛋白可以達到特異性識別特定序列的功能。Cas 蛋白可以在特定的gRNA 的引導下靶向結合對應序列。介於(yu) 上述兩(liang) 者具有的特異性靶向能力，在此基礎上可以加以改造以實現特異性激活轉錄（與(yu) VP16 轉錄激活蛋白）、表觀遺傳(chuan) 修飾（與(yu) DAM 轉移酶）、協同作用的效應子的多聚化模塊組裝（PDZ）。RNA 靶向的 Cas/dCas 係統（dCas9、Cas13、dRNaseH1 等)可用於(yu) 降解 mRNAs或作為(wei) 支架將堿基編輯{ADAR (腺苷脫氨酶)參與(yu) 腺苷-肌苷 RNA 編輯}和剪接因子定位到感興(xing) 趣的轉錄本上。

b：基於(yu) CRISPR 的抑製振蕩子：每個(ge) 操縱子同時表達報告熒光蛋白和靶向下一操縱子序列的 gRNA，引導 dCas9 蛋白前往結合並抑製該操縱序列基因轉錄表達。操縱子 1 表達的 gRNA 引導 dCas9 靶向結合操縱子 2 序列並抑製，此時操縱子 3 開啟表達抑製操縱子 1 從(cong) 而逐漸減緩對操縱子 2 的抑製.....三色係統中各個(ge) 組分呈現出周期性波動，在振蕩中循環往複。

a：細菌表觀遺傳(chuan) 記憶回路：鋅指阻遏蛋白為(wei) 負反饋調節控製自身蛋白水平，並特異性結合到操縱子 II 抑製下遊基因轉錄表達。當 DNA 甲基轉移酶 CCRM 引入後便會(hui) 甲基化操縱子 II 使得無法被阻遏蛋白抑製，開啟下遊報告基因 gfp 與(yu) CCRM-deg 表達，CCRM 產(chan) 生正反饋調節，不斷保持操縱子 II 甲基化狀態。當 MF-Lon 蛋白酶引入時便會(hui) 特異性降解帶有其降解標簽的 CCRM-deg 從(cong) 而關(guan) 閉甲基化，恢複原先被阻遏的狀態。

b：轉錄因子介導的 DNA 環：在 lacZ 和 tdTomato 基因上遊均具有一段LacI 操縱序列，當 LacI 四聚體(ti) 同時結合這兩(liang) 個(ge) 操縱序列時會(hui) 致使 DNA 彎曲形成環狀並使得 Ntrc 增強子與(yu) lacZ 基因啟動子靠近並增強表達量。倘若經過 IPTG 誘導 LacI 蛋白失去阻遏作用則無法成環，Ntrc 增強子優(you) 先增強下遊 tdTomato 基因轉錄表達。

蛋白質-蛋白質相互作用：

a：環境中信號分子結合細胞膜表麵分子受體(ti) ，該受體(ti) 磷酸化激活下遊信號分子引發級聯反應，最終效應分子進入細胞核調控基因表達，該基因表達產(chan) 物蛋白負反饋抑製將要入核的效應分子（轉錄激活蛋白等）。

b:模塊化設計組裝受體(ti) 結構，GEMS 和 SynNotch 中使用可定製的受體(ti) 支架（EpoR、Notch 等），在此基礎上定製並自由匹配組裝輸入（胞外受體(ti) 結構域）和輸出（胞漿信號轉導激活）結構域。其中，下遊反應結果可以是內(nei) 源性途徑的激活（磷酸化後的級聯反應等），要麽(me) 是合成效應物的釋放，該效應物隨後入核調控基因表達。

c：Degronlockr 是蛋白水解開關(guan) 模塊，同源關(guan) 鍵蛋白的引入與(yu) 該蛋白鏈接的標簽結構域（degron）互作並觸發暴露降解標簽的螺旋位移，導致該蛋白被蛋白酶體(ti) 特異性識別與(yu) 降解。

04、總結和展望

The fourth part

第一代合成生物學始於(yu) Jacob和Monod概述的操縱子模型的理論範圍內(nei) ，並在生物噪聲和自然基因調控網絡的研究中發揮了重要作用。然而，自分子遺傳(chuan) 學早期以來，研究者對基因表達調控的許多層麵的基本理解已經急劇擴大，為(wei) 新的調控策略和新部分的設計提供了信息。從(cong) 這些跨越現代中心教條的工程努力中，一個(ge) 普遍的主題浮現出來：曆史上的分子工具越來越多地被模塊化和可編程的生物分子所補充，這些生物分子可以連接各種合成係統和自然係統。

與(yu) 此同時，作者探索生物多樣性以尋找新活動和迅速重新利用現有工具的能力正在擴大可通過合成生物學控製的行為(wei) 範圍。隨著基礎研究和生物工程之間至關(guan) 重要的相互作用的繼續，作者預見了原核生物和真核生物合成生物學的新領域:配備了新的工具和更全麵的生物學模型，合成生物學家可以將合成係統更無縫地整合到自然係統中，並最大限度地減少對宿主的不利影響。這對於(yu) 需要工程細胞在實驗室之外的長期穩定性和自主行為(wei) 的應用尤為(wei) 重要。

參考文獻：[1] Monod J, Jacob F. 1961. General conclusions: teleonomic mechanisms in cellular metabolism, growth,and differentiation. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 26:389–401