文獻分享
Designing Biological Circuits: Synthetic Biology Within the Operon Model and Beyond（1）
本文回顧了Jacob和Monod所構想的電路藍圖如何為(wei) 第一代合成基因電路的構建奠定了基礎。這一藍圖的核心思想是，通過組合簡單的功能單元，按照編碼的分子機製運作，可以編程複雜的行為(wei) 。文中舉(ju) 例說明了微生物合成生物學中最常見的合成基因調控策略與(yu) Jacob和Monod早期預測之間的驚人相似之處。第一代合成基因電路對我們(men) 理解基因調控網絡的結構和功能以及噪聲在基因表達調控中的作用都有重要貢獻。
文章的後半部分重點介紹了生物化學和分子生物學在發現和開發可定製和可編程激活內(nei) 源性行為(wei) 的新分子工具方麵的作用。探討了基因調控的根本性進展如何在超越操縱子模型的工程策略方麵發展，以及合成基因線路如何幫助完善當代生物學模型。這些例子突出了基礎生物學和合成生物學之間持續而有建設性的相互影響。
PartⅠ.Synthetic biology within the operon model
本節主要討論了操縱子模型及其理論框架對早期合成生物學工作的深遠影響。文章首先對操縱子模型理論的結論和猜想做出總結，以便讀者更好地理解操縱子模型理論。隨後便開始闡述Jacob和Monod所提出的操縱子模型的藍圖，以及與(yu) 早期合成基因電路之間的驚人相似之處，討論了轉錄調控策略的擴展。
Ⅰ.雙穩態開關(guan) 和振蕩器
圖1.操縱子模型與(yu) 初代合成生物學基因線路。
a. 雙穩態開關(guan) 和振蕩器
(i) Jacob和Monod提出的雙穩態調控係統藍圖。這種結構能使帶有相同基因的細胞表現出兩(liang) 種不同的表型。由兩(liang) 個(ge) 假設的操縱子編碼兩(liang) 種抑製子，分別由相應的操縱基因控製。這種結構能夠建立起兩(liang) 種不同的、相互排斥的細胞狀態，取決(jue) 於(yu) 兩(liang) 種抑製因子中的哪一個(ge) 占主導地位，結構基因隻有在與(yu) 主要調控因子處於(yu) 同一個(ge) 操縱子時才能被表達。此外，他們(men) 還預測阻遏物能夠與(yu) 各自的配體(ti) 變構結合從(cong) 而被抑製，這樣係統就可以在兩(liang) 種穩定的狀態之間轉換。
(ii) 雙穩態開關(guan) ，初代合成基因線路之一，是上述模型的一個(ge) 實例。由兩(liang) 個(ge) 相互抑製的操縱子組裝而成，分別編碼細菌阻遏物LacI和噬菌體(ti) 阻遏物cI(或TetR)。與(yu) 上述的藍圖幾乎一樣，能讓細胞在兩(liang) 種狀態之間切換。
(iii) 另一種雙穩態開關(guan) 。用一個(ge) 單獨的自動激活因子取代了兩(liang) 個(ge) 相互對立的轉錄抑製因子，證實了正向調控可以支持雙穩態表達係統。σ因子sigW 處於(yu) 正向自動調節狀態。上遊可以設計兩(liang) 種調控方式。
①aTc與(yu) tetR結合，開啟sigW的表達，下遊的啟動子PσW開啟，起到一個(ge) 正反饋的效果，又有sigW的表達，同時開啟下遊yfp的表達；無aTc，sigW的表達被抑製，兩(liang) 個(ge) PσW都不開啟，無yfp的表達。
②有阿拉伯糖，反σ因子rsiW表達，阻隔sigW。
b. 依賴於(yu) 反饋調節的基因振蕩器。
(i)Jacob和Monod設計的基因振蕩器藍圖，可以讓基因表達產(chan) 生循環模式，同樣也是圍繞兩(liang) 個(ge) 不同的操縱子之間的相互調節來構建的。每一個(ge) 操縱子被另一個(ge) 調控因子抑製，同時編碼一種酶，催化小分子的生成。這些小分子可以反過來變構調節相反的調控因子。比如，操縱子1的代謝產(chan) 物可以解除操縱子2的抑製作用，而操縱子2的產(chan) 物可以促進操縱子1的抑製作用。據他們(men) 預測，在適當的生化參數條件下，兩(liang) 個(ge) 操縱子的活性會(hui) 隨時間產(chan) 生振蕩。
(ii)抑製振蕩子。不依賴於(yu) 混合調控和酶轉化，而是完全建立在轉錄抑製的基礎上，使用雙重抑製調控來替代藍圖中的正向調控。在該電路中，編碼三種抑製因子lacI,cI,TetR的基因以“菊花鏈”式連接，由tetR調控綠色熒光蛋白的產(chan) 生。有tetR產(chan) 生時，抑製cI和gfp的轉錄，cI的抑製作用解除，lacI能夠轉錄，反過來抑製tetR，一段時間後，tetR對cI和gfp的抑製作用被解除，產(chan) 生綠色熒光。而cI的表達又會(hui) 反過來抑製lacI，又逐漸解除lacI對tetR的抑製作用，一段時間後tetR又能夠表達，以此循環。細胞則表現出綠色熒光隨時間振蕩。
該線路的實現證實了自主的動態行為(wei) 能夠通過基因編輯來實現，為(wei) 節律理論創建了最小模型。以上這些線路的實現證實了調控基因和操縱基因的不同組合可以產(chan) 生複雜的行為(wei) 。
(iii)2008年，Stricker等人構建了一個(ge) 可調基因振蕩器，周期更短，振幅更大。使用雙輸入的混合啟動子，能夠同時響應激活子AraC和抑製子LacI，在基因網絡的每個(ge) 分支上同時實現正和負的自動調節。利用這兩(liang) 個(ge) 正交傳(chuan) 感器，他們(men) 可以對震蕩周期進行微調，使用阿拉伯糖和IPTG來進行參數調整。結果顯示，該線路可以在噪聲條件下穩定表達。
他們(men) 進一步探索該模型，揭示了一個(ge) 簡單的由自抑製LacI元件組成的負自調節電路足以產(chan) 生振蕩，被稱為(wei) Goodwin振蕩器的結構，實驗驗證後，作者將其歸因於(yu) lacI基因表達與(yu) 活性lacI TF複合物形成之間的固有延遲。
Ⅱ.正反饋和負反饋
他們(men) 將反饋調控的概念延申到基因調控網絡。反饋可以來自調控因子直接對自身的調控（自動調控），或間接通過其目標操縱子的下遊產(chan) 物來調控。研究表明，負反饋自動調節可以提高遺傳(chuan) 線路的穩定性。
Becskei和Serrano開發了一種最小的合成基因線路，使用熒光標記的TetR阻遏物，在兩(liang) 種情況下測量了蛋白質水平在種群範圍內(nei) 的分布：a.將tet操縱基因置於(yu) tetR-gfp融合基因上遊的自動調節係統。b.tetR-gfp的表達不受調控。結論顯示，在噪聲存在的情況下，自動調節提高了表達的穩定性，減少了大腸杆菌種群中的基因表達異質性。
由此提出一個(ge) 猜想，即操縱子產(chan) 生自身誘導物，會(hui) 表現出全有或全無的轉錄行為(wei) 。而事實上，早期酵母自我激活的TetR轉錄因子的研究表明，在雙穩態開關(guan) 轉換中存在正向自動調節。隨後便有研究者在大腸杆菌中開發了類似的正反饋調節係統模型。
圖2.操縱器模型的藍圖及其構建，包括DNA水平和RNA水平兩(liang) 方麵
a.DNA水平操縱器
（i）DNA水平操縱器的操縱子模型。調控基因的表達產(chan) 物作用於(yu) 下遊的操縱基因，抑製轉錄的發生。
（ii）級聯係統。由兩(liang) 層級聯係統，分別由兩(liang) 種熒光蛋白表征，和一個(ge) 單獨的報告基因rfp組成。單獨的報告基因有利於(yu) 衡量噪聲的影響。lacI正常轉錄時，抑製Olac，使tetR和cfp不能轉錄，無青色熒光，tetR不能轉錄的情況下，yfp能表達，產(chan) 生黃色熒光。如果存在IPTG，lacI對Olac的抑製作用解除，tetR和cfp開啟轉錄，產(chan) 生青色熒光，tetR轉錄抑製Otet，yfp不能轉錄，無黃色熒光。如果IPTG和aTc同時存在，aTc結合TetR，解除其抑製作用，則青色熒光和黃色熒光同時表達。
（iii）自動設計邏輯線路。使用基於(yu) NOT/NOR的結構，將用戶定製的二進製邏輯行為(wei) 作為(wei) 輸入，設計複雜的轉錄級聯以在大腸杆菌中實現該邏輯。以小分子誘導劑，如IPTG和aTc等作為(wei) 輸入，讓用戶編輯特定行為(wei) 。該圖展示的是一個(ge) NAND邏輯門(與(yu) 非門)結構。當aTc單獨存在時，Ptet被解抑製，srpR表達，激活PSrpR，使yfp表達；同理，IPTG單獨存在時yfp表達；aTc和IPTG都不存在時，PSrpR和PPhlF都被激活，yfp表達；aTc和IPTG都存在時，PSrpR和PPhlF都不能被激活，yfp不表達。
b. RNA水平的操縱器
（i）Jacob和Monod在模型中假設調控因子(反義(yi) RNA或TF蛋白質)可以靶向mRNA上的特定控製位點，阻礙翻譯過程，由此建立了這個(ge) 操縱器模型。
（ii）轉錄後調控策略。設計非編碼RNA特異性阻礙mRNA的翻譯，利用反義(yi) RNA的莖環結構阻礙核糖體(ti) 與(yu) RBS的結合，從(cong) 而阻止翻譯過程。基於(yu) 該平台開發了一種配體(ti) 響應式翻譯RNA開關(guan) 係統，通過特定小分子(如茶堿)與(yu) 反義(yi) RNA特定位點的結合改變反義(yi) RNA的構象從(cong) 而使反義(yi) 結合結構域隔離或暴露。
（iii）Toehold switch是一種人為(wei) 設計的轉錄後調控因子，可編輯的RNA分子與(yu) mRNA結合並將RBS隔開在莖環區域，使核糖體(ti) 無法結合。經過改造，RBS的隔離與(yu) 暴露可以被特定的RNA小分子誘導調控。
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