2023 ZJU-China iGEM課題分享

iGEM課題分享 Flora Sentinel

2023 ZJU-China

獲獎情況

在2023 iGEM比賽中，ZJU-China榮獲金獎並斬獲TOP 10大獎以及最佳建模、最佳農(nong) 業(ye) 課題、最佳植物合成生物學、最佳展示和最佳網頁六項單項獎。

PARTⅠ Background

作物病蟲害和雜草是維持穩定的農(nong) 業(ye) 生態係統的三大挑戰，疾病暴發對全球糧食安全和環境可持續性構成重大風險，導致初級生產(chan) 力和生物多樣性的喪(sang) 失。農(nong) 業(ye) 中的傳(chuan) 統化學殺蟲劑會(hui) 帶來許多危害。它們(men) 會(hui) 危害人類健康，以及通過在空氣中漂移，滲入土壤和水中，傷(shang) 害有益生物來汙染環境和生物多樣性。過度使用還會(hui) 導致殺蟲劑耐藥性。因此，浙江大學的團隊提出了利用人工合成的基因通路與(yu) 植物的先天免疫通路作用。開發一個(ge) 更安全和更有效的生物殺蟲劑，使植物能夠擁有與(yu) 人類相似的生物殺蟲劑產(chan) 品疫苗。

PARTⅡ Principle

一、植物免疫係統

植物擁有強大的先天免疫係統，包括PTI和ETI途徑。PTI依賴細胞表麵受體(ti) 識別，而ETI依賴細胞內(nei) 蛋白，例如NLR。病原體(ti) 經常分泌阻礙PTI的效應器，使ETI對於(yu) 長期植物防禦和兩(liang) 種途徑的整合至關(guan) 重要。 因此，浙江大學的項目主要研究NLR及其在ETI途徑中的作用。

圖1 先天植物免疫通路：PTI和ETI

二、NLR蛋白

NLR家族、廣泛存在於(yu) 植物細胞。它們(men) 通過識別和防禦在生物體(ti) 的免疫係統中起著至關(guan) 重要的作用，阻止寄生蟲、病毒和細菌的入侵。

它們(men) 是植物細胞中的受體(ti) ，可檢測病原體(ti) 效應物並啟動免疫反應。它們(men) 分為(wei) 受體(ti) NLR和信號NLR。受體(ti) NLR識別效應器，同時發出信號 NLR 觸發器免疫反應。NLR結構由N端、NB-ARC和LRR結構域組成。每個(ge) 域都有識別特定效應器的能力。

圖2 NLR的結構和分類

三、ID序列

ID序列的結構與(yu) 致病效應子的靶蛋白極其相似，使其能夠競爭(zheng) 性結合效應子，成為(wei) 免疫反應的有效識別方法。

當前的ID序列缺乏緊密的綁定和特異性。因此，浙江大學提出將ID序列替換為(wei) 一個(ge) 特殊的工程納米抗體(ti) ，能夠精確地結合效應子，同時仍然保留募集能力。

圖3 免疫受體(ti) 修飾的機製

PARTⅢ Design

一、TLS序列

TLS已被發現具有運輸RNA分子的能力，這種能力可以幫助在植物維管束中轉運RNA分子。

為(wei) 了讓他們(men) 的RNA從(cong) 農(nong) 杆菌侵染部位擴散到整個(ge) 植物，然後表達靶蛋白在整個(ge) 植物中，浙江大學團隊在RNA中添加TLS模塊。

他們(men) 嚐試了來自不同物種的不同氨基酸的TLS，並修改了它們(men) 的序列以找到幾種對RNA遷移率最有幫助的序列。優(you) 化的添加了TLS的RNA可以在植物維管中移動，並在未轉化的植物細胞中表達靶蛋白。

圖4 TLS模塊的結構和功能

二、RdRp模塊

在疫苗中使用RNA的一個(ge) 突出局限性是其固有的不穩定性，導致半衰期縮短。浙江大學團隊將煙草花葉病毒(TMV)的複製酶組裝到他們(men) 的RNA上。TMV是一種單鏈RNA病毒。TMV 的複製酶可以將基因組(+)RNA 轉錄為(wei) 基因組(-)RNA。然後，基因組(-)RNA可以作為(wei) 產(chan) 生原始基因組RNA新拷貝的模板，也用於(yu) 生產(chan) 表達目標蛋白質的亞(ya) 基因組RNA。因此，RdRp模塊可以幫助延長RNA的半衰期，也增加了靶蛋白的表達時間。

圖5 RdRp模塊的功能

三、植物免疫模塊

他們(men) 選擇了NLR蛋白的兩(liang) 個(ge) 基因，pikm1和pikm2。Pikm1是接收器，NLR負責識別；而Pikm2 是信號NLR，觸發即時響應。

他們(men) 用納米抗體(ti) 代替ID序列，這種納米抗體(ti) 具有更強的特異性及結合能力，同時保留ID序列的原有功能。

由於(yu) 需要傳(chuan) 感器和輔助蛋白來激活植物免疫力，他們(men) 設計了兩(liang) 種功能性路徑，位於(yu) 兩(liang) 種不同類型的工程細菌中，以減少人工合成的影響工程細菌生長的基因。

圖6 植物免疫模塊

四、生物安全模塊

在本模塊中，他們(men) 設計了一種在農(nong) 杆菌中表達的組成型啟動子，實現了對農(nong) 杆菌的調節。組成型啟動子與(yu) 光毒性蛋白協調細胞死亡，確保我們(men) 項目的安全性。

(1)光感應終止開關(guan)

他們(men) 首先選擇KillerRed進行自殺。KillerRed 是一種產(chan) 生活性氧(ROS)的紅色熒光蛋白，在黃綠光下，可用作生物安全應用的終止開關(guan) 。基於(yu) 此，他們(men) 對蛋白進行了點突變，並驗證了它是否具有更強的自殺開關(guan) 效果。

此外，他們(men) 合成了優(you) 化的miniSOG基因，這是一個(ge) 光毒性蛋白。光照後，miniSOG產(chan) 生殺死細菌的氧氣物質。為(wei) 了在農(nong) 杆菌中使用這種蛋白質，他們(men) 優(you) 化了它的密碼子。

(2)增強子

他們(men) 嚐試各種誘導型和組成型啟動子，並選擇最合適的一種作為(wei) 自殺開關(guan) 。最後，他們(men) 選擇了組成型啟動子50Spro，並對該啟動子進行定向進化，使其強度更適合控製細菌的生物安全模塊。

圖7 生物安全模塊

PARTⅣ Results

一、TLS模塊驗證

TLS基序的折疊結構觸發了維管束植物中RNA的運動，且莖(8至12個(ge) 核苷酸)-可變凸起–莖(4至7個(ge) 核苷酸)-環結構對RNA的遷移至關(guan) 重要。為(wei) 了估計預測tRNA的二級結構，實驗者對擬南芥的20個(ge) tRNA進行了二級結構預測(圖8)，篩選出結構合適的tRNA：Met和Met ΔΔT。

圖8 Met tRNA(A)，Met ΔΔT(B)， Ala tRNA(C)和His tRNA(D)二級結構預測

為(wei) 了驗證這兩(liang) 種tRNA的運輸功能，用這兩(liang) 種tRNA的TLS構建質粒pGREENII-GFP-TLS，將質粒電轉進入農(nong) 杆菌後，通過農(nong) 杆菌注入植物葉片的標記區域進行瞬時表達。結果顯示，對於(yu) 攜帶GFP的mRNA，注射區域外沒有檢測到明顯的熒光信號光，卻檢測到了GFP mRNA(圖9)，說明TLS能攜帶GFP mRNA進行遷移。

圖9 注射區域外葉片樣品的相對GFP mRNA水平

上述實驗種注射區域外沒有熒光信號的可能原因是GFP的熒光信號太弱，導致其無法檢測到。因此又構建了質粒pGREENII-RUBY-TLS，在煙草葉片的標記區域進行瞬時表達。注射區域外有RUBY催化酪氨酸形成的紫紅色斑點，注射區外也有RUBY mRNA的出現，但其遷移能力不如GFP mRNA(圖10)，說明TLS能攜帶RUBY mRNA進行遷移，遷移的RUBY mRNA也能成功表達，RUBY mRNA遷移能力的減弱可能是由於(yu) RUBY mRNA(~4kbp)長於(yu) GFP mRNA(~800bp)。

圖10 RUBY的可視化表達(A)和相對RUBY mRNA水平(B)

由於(yu) GFP mRNA和RUBY mRNA長度差異較大，實驗者又決(jue) 定將GUS作為(wei) 報告基因。作者還希望研究其它TLS的遷移水平，於(yu) 是構建了其它TLS的PGREENII-GUS-TLS質粒。結果顯示，除了上述TLS之外，擬南芥的Ala tRNA也可以驅動mRNA運動(圖11)。

圖11 Ala tRNA驅動注射區域外葉片的GUS表征

二、RdRp模塊驗證

為(wei) 了驗證RdRp對於(yu) RNA的保持功能，他們(men) 首先構建了表達RdRp質粒，並用GFP進行表征。他們(men) 首先克隆了TMV全基因組進入 pGreenⅡ，用GFP基因替換TMV亞(ya) 啟動子CPORF，構建出質粒pGreenⅡ-RdRp-subPromoter CP-GFP，又用GFP基因替換TMV亞(ya) 啟動子MP的ORF，構建出另一個(ge) 質粒pGreenⅡ-RdRp-subPromoter MP-GFP。

成功構建質粒後，用農(nong) 杆菌轉化煙草，在熒光顯微鏡下觀察結果，發現相較於(yu) 用CaMV 35s啟動子直接表達GFP，表達RdRp的兩(liang) 組發出更強的熒光(圖12)。之後，他們(men) 又檢測了GFP蛋白的表達情況，通過熒光光譜法測定了GFP在葉片中總可溶性蛋白提取物中的含量，發現RdRp的表達顯著增加了總可溶蛋白中的GFP的相對熒光強度(圖13A)，通過Western Blot(WB)也證明了有RdRp存在時GFP的相對表達量升高(圖13B)。此外，他們(men) 還通過RT-qPCR進行了GFP的mRNA含量檢測，發現RdRp存在導致GFP mRNA含量增加(圖14)。檢測GFP的mRNA和蛋白質隨時間的變化，發現RdRp的存在可以減緩mRNA和蛋白質的降解，延長mRNA和蛋白質的半衰期(圖15)。上述結果均證明了RdRp可以發揮良好的複製作用並增加靶RNA的數量和表達水平。

圖12 熒光顯微鏡下觀察GFP的熒光強度

圖13 通過熒光光譜法(A)和WB(B)檢測GFP的蛋白表達強度

圖14 GFP mRNA的相對含量檢測

圖15GFP mRNA的相對含量檢測

接著，他們(men) 探究了TLS與(yu) RdRp融合對兩(liang) 者功能的影響。由於(yu) TLS的二級結構和TMV 3' UTR的二級結構對RNA的遷移和自我複製至關(guan) 重要，他們(men) 預測了TLS與(yu) TMV 3' UTR融合後的二級結構，發現TLS與(yu) TMV 3' UTR的融合基本不影響兩(liang) 者的二級結構(圖16)。然後，他們(men) 測定了RdRp和TLS融合後的遷移率變化，發現融合後TLS仍能行使遷移功能，而RdRp也能增強熒光強度(圖17)。

圖16 TLS與(yu) RdRp融合二級結構預測

圖17 RdRp 和 TLS融合後的遷移率測定

三、植物免疫模塊測定

實驗者從(cong) 含有具有Pikm抗性基因的水稻根中通過RT-PCR獲得了pikm1和pikm2基因，又購買(mai) 了GFP納米抗體(ti) 基因序列enhancer，用於(yu) 替換Pikm1中的ID序列，構建了質粒pGreen-pikm2，pGreen-GFP，pGreen-pikm1 (enhancer)和Pgreen-TMV-GFP。用pikm-1(enhancer)+ pikm-2 + GFP(NLR*)作為(wei) 實驗組，pikm-1(enhancer)+ pikm-2 (NLR)作為(wei) 對照組，空農(nong) 杆菌作為(wei) 陰性對照，GFP作為(wei) 陽性對照，分別瞬時轉化進入煙草葉中。

直接觀察表型，發現與(yu) 陽性對照相比，改造後NLR的轉入可以顯著降低葉片上能觀察到的熒光(圖18)。又對轉化後的葉片進行總蛋白提取並檢測熒光強度，發現改造後NLR也能降低總蛋白中的熒光強度(圖19)。再使用WB對GFP蛋白進行檢測，發現改造後NLR降低了GFP蛋白的表達量(圖20)。上述結果顯示，改造後的NLR能夠中和GFP蛋白，降低其含量。

圖18 瞬時轉化後煙草葉表型

圖19 葉總蛋白提取物中熒光測量

圖20 GFP的WB檢測

活性氧(ROS)信號傳(chuan) 導在植物先天免疫反應中起著重要作用，可以直接抑製病原體(ti) 的生長，也可作為(wei) 信號分子促進植物免疫應答，其快速產(chan) 生是植物防禦係統激活的重要標誌。在農(nong) 杆菌注入一周後，用ROS試劑盒進行檢測，以測定植物的免疫係統激活情況。結果顯示NLR*的轉入能使ROS顯著上升，植物免疫係統顯著激活(圖21)。

圖21 ROS含量的測量

四、生物安全模塊驗證

為(wei) 了選擇激發自殺開關(guan) 的合適啟動子，實驗測試了4 個(ge) 啟動子，分別是組成型啟動子 50Spro，乙酰丁香酮誘導型啟動子Pvbp2，D-阿洛酮糖觸發的PsiA和由4-異丙基苯甲酸誘導的Ptac/cuo啟動子，使用GFPuv作為(wei) 報告基因。結果顯示組成型啟動子50Spro表現出明顯的綠色熒光，誘導型啟動子中僅(jin) Pvbp2顯示弱熒光(圖22)。

由於(yu) 誘導型啟動子Pvbp2在啟動子表征實驗中的表達較弱，並且乙酰丁香酮具有毒性，實驗者最終選擇了50Spro作為(wei) 啟動子來驗證光毒性蛋白的自殺作用。他們(men) 對50Spro進行了優(you) 化。他們(men) 從(cong) NCBI中提取了根癌農(nong) 杆菌每個(ge) 基因前的40 bp序列作為(wei) 啟動子，並分析啟動子的保守位點，發現了12 個(ge) 非保守位點，然後使用簡並引物對這12 個(ge) 堿基進行突變以構建突變文庫(圖23)，使用GFPuv作為(wei) 報告基因進行啟動子強度的篩查，得到了50Spro-e1與(yu) 50Spro-e2兩(liang) 個(ge) 啟動子，其產(chan) 生報告基因熒光強度顯著高於(yu) 未突變的啟動子(圖24)。

圖22 啟動子50Spro與(yu) 啟動子Pvbp2熒光表達強度檢測

圖23 農(nong) 杆菌啟動子非保守位點(a)的估計和測序結果(b)

圖24 定向進化啟動子熒光表達強度檢測

確定啟動子後，實驗者選擇了兩(liang) 種蛋白作為(wei) 農(nong) 杆菌自殺蛋白，分別是在黃綠光(540-585 nm)下產(chan) 生活性氧(ROS) 的蛋白質KillerRed和在藍光激發下產(chan) 生有毒物質的蛋白質miniSOG。將攜帶有自殺蛋白基因的農(nong) 杆菌在不同光強下誘導自殺，對細菌溶液的實驗結果表明，細菌沒有表現出來顯著減少(圖25)，這可能有利於(yu) 細菌的保存和運輸。而細菌平板實驗表明，在光線照射下，工程細菌明顯減少(圖26)，說明了自殺係統起作用。

圖25 KillRed自殺蛋白(A)和miniSOG自殺蛋白(B)對溶液中細菌的作用

圖26 KillerRed對平板細菌的清除效果(暗對照，10 分鍾，20 分鍾， 30分鍾)

PARTⅤ HP

在教育宣傳(chuan) 上，他們(men) 開展了食品科普活動、青海省誌願者教學活動，學軍(jun) 中學宣傳(chuan) 活動等多種活動，向中小學生和社會(hui) 公眾(zhong) 宣傳(chuan) 食品健康知識和合成生物學知識。他們(men) 還積極進行學術交流，參加走近合成生物學-2023iGEM交流會(hui) 與(yu) CCiC，和外校學生展開積極交流。為(wei) 了了解公眾(zhong) 對於(yu) 他們(men) 項目的認知，他們(men) 多次對話利益相關(guan) 者，並通過問卷調查了解公眾(zhong) 對於(yu) 農(nong) 作物病蟲害與(yu) 合成生物學的認識。