iGEM課題分享——2023 SZU-China

iGEM課題分享PolycoBeadiGEM 2023 SZU-China

Ⅰ.獲獎情況

在2023年iGEM大賽中，SZU-China榮獲金獎並斬獲TOP10大獎以及最佳農(nong) 業(ye) 課題、最佳部件收集、最佳基礎部件、最佳網頁提名四項單項獎項。

Ⅱ.背景

番茄在全球農(nong) 作物中占有重要地位。灰黴病會(hui) 在收獲後的貯運過程加速作物的變質， 造成嚴(yan) 重的物流損失。灰黴菌通過菌核和分生孢子潛伏並傳(chuan) 播感染番茄等作物，目前的防治手段主要是通過化學農(nong) 藥進行防治，但存在時效短、汙染環境、農(nong) 藥殘留等問題。

因此，SZU-China團隊設計了一種名為(wei) PolycoBead的產(chan) 品。該產(chan) 品靈感來源於(yu) 洗衣凝珠，其外膜為(wei) 可水解水溶性聚乙烯醇（PVA）薄膜，內(nei) 部分為(wei) 兩(liang) 種體(ti) 係，其一是負責實現RNA幹擾的CPP-shRNA，另一部分則是負責刺激植物免疫的經改造枯草芽孢杆菌。

Ⅲ.Design

1.通過構建shRNA實現RNAi技術

RNAi技術：shRNA由Dicer或Dicer-like加工成siRNA,與(yu) Ago蛋白結合形成RNAi沉默複合物（RISC），與(yu) mRNA結合使mRNA被降解或阻止翻譯。

RNAi技術優(you) 點：

特異性靶向：僅(jin) 靶向和沉默灰芽孢杆菌的必需基因，而不會(hui) 引起對其他生物的傷(shang) 害。

環境友好型：RNAi分子容易降解，因此對環境友好。

可控：RNAi 生物農(nong) 藥不會(hui) 引起植物基因表達的永久性變化且受人為(wei) 控製。

靶向位點：

Bcpme1：B.cinerea 表達PME的重要基因，果膠甲基酯酶（PME）是一種水解酶，可催化植物細胞中果膠分子上的α酯鍵水解，而果膠是植物細胞壁的主要成分之一。

BcOAH：在感染期間，灰芽孢杆菌會(hui) 表達草酰乙酸水解酶，催化草酰乙酸在B. cinerea中轉化為(wei) 草酸。草酸進入宿主植物，宿主中的遊離鈣離子可形成草酸鈣結晶，容易引起植物堵塞的症狀。草酸的釋放還可以抑製活性氧（ROS）的爆發，不利於(yu) 植物免疫防禦，BcOAH能夠幫助產(chan) 生草酸。

BcDCL1 和 BcDCL2：灰芽孢杆菌的二分體(ti) 蛋白DCL1和DCL2參與(yu) siRNA的合成。然後siRNA將被遞送至宿主植物細胞以參與(yu) RISC複合物在宿主RNAi機製中的形成， 隨後沉默和抑製宿主免疫相關(guan) 基因，使植物細胞更容易受到感染。

Bccyp51：麥角甾醇 （ERG） 是一種 C28 甾醇，存在於(yu) 真菌細胞膜中，負責維持膜的流動性， 調節膜通透性，影響膜相關(guan) 酶活性，並影響真菌細胞生長。

BcCHSIIIa：幾丁質合酶基因，幾丁質是真菌細胞的主要結構成分。

對以上靶向基因及對應的shRNA進行查詢比對，保證生物安全性。

2.shRNA分子的遞送

單獨的shRNA分子無法有效進入靶標 細胞並發揮其作用。

CPP：是一種短鏈氨基酸，由約30種氨基酸組成，包括堿性氨基酸和 R 基團，可用於(yu) 遞送生物分子如siRNA、pDNA、質粒和蛋白質。工程化CPP和shRNA分子通過帶正電荷的氨基酸殘基相互作用，如精氨酸和賴氨酸與(yu) 磷酸鹽骨架帶負電荷的核酸形成亞(ya) 微米肽-核酸複合物。

BP100-(KH)9是一種高效融合的具有BP100 域名的生物分子結合的細胞穿透肽 ，KH9提高生物分子進入植物細胞的交付效率。BP100-(KH)9在分子力顯微鏡（AFM）下顯現球形，可以包裹shRNA分子形成球形複合物。

BP100-(KH)9組合shRNA簡單，將兩(liang) 種物質按一定比例混合，讓它們(men) 在室溫下靜置一段時間，即可獲得 CPP-shRNA的複合物。這種非共價(jia) 結合方法具有穩定性和可逆性，從(cong) 而實現轉移和生物分子的功能。

串聯shRNA分子：

對於(yu) RNAi所可能發生的效果不佳，靶序列脫靶等問題，SZU采用了串聯多個(ge) RNAi分子的機製來解決(jue) 這些問題。串聯後的RNAi有效率更高，在計量更低的情況下達到了更好的作用效果。

3.植物免疫途徑

植物免疫途徑分為(wei) 兩(liang) 種，Pathogen-associated molecular patterns Triggered Immunity (PTI)和Effector Triggered Immunity (ETI)兩(liang) 種。

PTI：植物與(yu) 病原物發生相互作用時，植物細胞膜上的模式識別受體(ti) （PRRs） ，可以識別病原物產(chan) 生的保守的病原偶聯分子模式（PAMPs） ，並進一步引起一係列的級聯應答反應，使植物發生針對PAMPs的防禦反應，稱之為(wei) PAMPs激發的免疫反應（PTI），也稱之為(wei) 基礎免疫反應。PAMPs是病原物在進化過程中非常保守的一類分子，例如幾丁質、脂多糖、膚聚糖、鞭毛蛋白等。植物體(ti) 表麵的PRRs正是可以識別這些保守的PAMPs，進而激活PTI，構成了植物防禦的第一道防線。另外，在病原侵入植物後，被病原物入侵後降解產(chan) 生的植物角質層碎片和細胞壁碎片也可以作為(wei) 危險相關(guan) 分子模式（DAMPS）被PRRs識別，激活PTI。

ETI：在植物和病原體(ti) 協同進化的過程中，病原體(ti) 通過自身的分泌係統分泌效應因子（ Effector）進入外質體(ti) 或者直接進入植物細胞，幫助病原體(ti) 克服植物的基礎免疫反應，完成對植物的侵染。病原體(ti) 通過效應因子引起的植物感病的現象稱為(wei) 效應因子激發的感病反應（ETS）。針對效應因子的出現，植物也進化出了一類基因，稱之為(wei) R基因，其編碼的蛋白可以直接或間接識別效應因子，引起植物體(ti) 內(nei) 活性氧的產(chan) 生、鈣離子濃度的升高、MAPK級聯反應的激活以及相關(guan) 防衛基因的表達等一係列反應，對抗效應因子引起的致病反應起到抑製的作用。這類免疫反應稱為(wei) R基因介導的免疫反應，也稱為(wei) 效應因子激發的免疫反應（ETI）。

對比：相比植物的基礎免疫，效應因子激發的免疫反應的反應強度更大，抗病效果也更加明顯。伴隨著ETI的發生，植物被病原物侵染的部位經常會(hui) 發生局部的細胞程序化死亡（PCD），引發植物對病原物的超敏反應（HR），使病原物不能在侵入部位獲取相應養(yang) 分，以及誘導周圍細胞合成抑製病原物生長所需物質，最終抑製病原物的進一步蔓延。

誘導因子選擇：

BvEP：一種來自Bacillus velezensis LJ02的蛋白磷酸化酶

flg22：銅綠假單胞菌鞭毛蛋白具有22個(ge) 氨基酸的N末端肽

4.工程枯草芽孢杆菌

改造：BvEP的核酸序列具有與(yu) 枯草芽孢杆菌具有高度同源性，枯草芽孢杆菌具有簡單的遺傳(chuan) 背景和強大的蛋白質表達係統。因此，在枯草芽孢杆菌同時表達蛋白質免疫誘導因子BvEP和Flg22來誘發植物免疫可能實現1+1>2的效果。

使用強啟動子Pveg表達免疫誘導因子BvEP。Pveg是枯草芽孢杆菌中連續表達靶基因的啟動子，包含兩(liang) 個(ge) 枯草芽孢杆菌主要σ因子a1的結合位點，可以使基因有效表達。同時，選擇2x Fd終止子作為(wei) 表達通路的終點。

自殺開關(guan) ：

通過對蔗糖的濃度的調控進而調控工程菌的自殺。

該自殺係統使用MazE與(yu) mazF作為(wei) 自殺的毒性基因，當蔗糖濃度較高時，PsacB得以轉錄翻譯出mazE進而與(yu) mazF結合解毒，當蔗糖濃度不夠時，mazE不足以結合mazF，從(cong) 而使得mazF通過切割mRNA阻斷細菌中蛋白的合成，從(cong) 而導致細菌的生長抑製和死亡。

5.產(chan) 品PolycoBead

根據綜合人類實踐，農(nong) 藥濫用是當今農(nong) 業(ye) 中普遍存在的問題。當農(nong) 民施用殺蟲劑時，農(nong) 藥製劑農(nong) 民可以在市場上購買(mai) 通常容量大，並且即使農(nong) 藥的最佳施用量是標明在包裝或使用說明書(shu) 上，農(nong) 民會(hui) 主觀添加過量，導致增加農(nong) 作物中的農(nong) 藥殘留，甚至擴散到環境中。此外，由於(yu) RNAi生物農(nong) 藥的不穩定性，RNA分子很容易被環境中的核酸酶降解，因此非常有必要將RNAi生物農(nong) 藥與(yu) 環境，從(cong) 而減少和避免RNA降解。

Polycobead采用高醇解度的水溶性聚乙烯醇（PVA） 作為(wei) 外膜，將我們(men) 的CPP-shRNA 製劑和工程枯草芽孢杆菌包裹在一起，形成凝珠。由於(yu) PVA薄膜是水溶性材料，當農(nong) 民使用我們(men) 的Polycobead，他們(men) 隻需要把它放進一定體(ti) 積的水中，並且快速溶解後可直接噴入田間。

優(you) 點：

·常溫下能快速溶解

·能自然降解

·溶解後能改善土壤條件

·機械強度高

·能避免RNA降解

·容易獲得

Ⅳ.Result

1.shRNA分子

總共選擇了 6 個(ge) 靶基因作為(wei) 的 RNAi 沉默目標。此外，還連接了 2 個(ge) 靶向 shRNA B. cinerea的生存基因與(yu) 特異性對ATGCCT進行測序，以構建名為(wei) shRNA（Box-survival）的bi-shRNA。還串起了4個(ge) 靶向相關(guan) 關(guan) 鍵基因的 shRNA 在西紅柿上的灰芽孢杆菌感染中，並將其命名為(wei) shRNA(Box-infect)。

在選擇了上述靶基因後，設計了相應的shRNA分子通過CDS序列的靶基因。在BLAST並確認其特異性後總核酸文庫，通過XbaI限製性位點序列-檢測RNAi片段-環- 反義(yi) RNAi 片段 - BlpI 限製性位點，以及將其連接到pET-28a(+)質粒以獲得我們(men) 的shRNA表達向量。

2.IPTG誘導生產(chan) 進行質粒及shRNA驗證

shRNA 表達載體(ti) 成功轉入且成功提取了預期大小的我們(men) 的 shRNA。

構建IPTG調控表達通路，驗證所選的免疫誘導因子PehA， Flg22、3xFlg22 和 BvEP 可以激活植物免疫力。

不同重組質粒的條帶 通過PCR擴增的都是預期的大小，表明質粒成功轉化為(wei) 大腸杆菌BL21（DE3）。

掃描電子顯微鏡下CPP包裹shRNA

3.蛋白質驗證

測定後改善條件以增加蛋白質產(chan) 量

通過SDS-PAGE證明已經成功表達

通過WESTERN-blot驗證成功表達

4.DAB染色實驗

PehA、1x flg22 和 3x flg22表達蛋白質的量太低，無法滿足隨後的DAB實驗，因此在後來被放棄實驗。

ROS的爆發是植物免疫激活的指標，因此進行了DAB染色實驗，以檢驗不同濃度的BvEP處理後番茄葉片中ROS爆發的程度。DAB染色結果越暗，葉片中的ROS越多。在實驗中，對照組1用清水處理，並對照組 2 用大腸杆菌 BL21（DE3）中提取的總蛋白處理，無需誘導。

（a）浸泡方法應用BvEP。低：10ug/ul，中：25ug/ml，高：50ug/ml。（b）滴法塗抹BvEP。低：40ug，中：100ug，高：200ug。

染色後，使用ImageJ軟件進行灰度處理分析用兩(liang) 種不同的BvEP處理的葉子，量化免疫強度的方法，然後進行 t 檢驗確定不同BvEP之間的顯著差異濃度。灰度較低，即棕色較多沉澱在葉子中，表明ROS的爆發更強。

從(cong) 上圖可以看出，無論使用浸泡或滴落方法，ROS的爆發程度葉子隨著施用的BvEP濃度的增加而增加。

Ⅴ.HP

“5I循環”（靈感、構思、信息收集、 改進和互動，實施和想象）。

Ⅵ.Highlights

采用無細胞係統進行RNAi分子生產(chan) 。

對硬件進行了改進，解決(jue) 了實際生產(chan) 中的部分問題並降低了成本。

采用工程菌＋RNAi的方式複合保護番茄植株，比單一保護方式更為(wei) 有效。

產(chan) 品應用方法非常簡易。