文獻分享 | 關於土壤凍脹的背景調研以及解決土壤凍脹的相關措施

2023文獻標題：

1.中國茶樹春霜凍害研究進展

2.Elucidating the Sluggish Water Dynamics at the Ice-Binding Surface of the Hyperactive Tenebrio molitor Antifreeze Protein

3.Beetle and mussel-inspired chimeric protein for fabricating anti-icing coating

4.Isolation and identifcation of fve cold‑inducible promoters from Oryza sativa

5.In Planta Monitoring of Cold-Responsive Promoter Activity Reveals a Distinctive Photoperiodic Response in Cold Acclimation

DOI號：

1.10.11898/1001-7313.

20210201 2.10.1021/acs.jpcb.2c06478

3.10.1016/j.colsurfb.2021.112252

4.10.1007/s00425-017-2765-x

5.10.1093/pcp/pcaa138

關(guan) 鍵詞：

1.茶樹春霜凍；危害機理；災害指標；時空分布；影響與(yu) 風險評估

2.TmAFP; IBS; molecule dynamics（MD）; NIBS

3.Anti-icing coating; Beetle and mussel-inspired ; Antifreeze protein ; Synthetic biology

4.Cold stress; GUSplus; Homozygous generations; Inducible promoters; Transgenic rice

5.Cold acclimation; COR15A; In planta moni-toring; Photoperiod; Photosynthetic electron transport

主要內(nei) 容：

1.背景調研

通過閱讀相關(guan) 文獻可知，凍土是指零攝氏度以下，並含有冰的各種岩石和土壤。而土壤凍脹力則是當土壤中液態水轉變為(wei) 固態水時造成的土壤體(ti) 積膨脹及土壤顆粒間的相互擠壓。

凍土主要可分為(wei) 三類：永久性凍土、季節性凍土和暫時性凍土。我國凍土的分布大致如圖 1 所示，由圖可知，大部分永久性凍土及季節性凍土分布在東(dong) 北、西北及華北地區。而通常由雨雪、霜凍造成的暫時性凍土則在長江中下遊以南的南部地區也有廣泛分布。

圖1：2008 年中國 1:1000 萬(wan) 凍土分布圖(來自中國冰川凍土沙漠科學數據中心)

考慮到目前北方地區的大麵積凍土尚無有效可行的解決(jue) 措施，針對北方凍土問題人們(men) 也因地製宜地想出了許多具體(ti) 可行的防治措施。因此，我們(men) 將目光聚焦在了由極端天氣 (寒潮、霜凍等) 造成的南方地區的暫時性凍土問題上。

南方地區種植的許多糧食作物和經濟作物 (茶樹、橘樹等) 在寒潮來臨(lin) 時產(chan) 量和質量都受到了極大的損失[1]。

對於(yu) 糧食作物，以冬小麥為(wei) 例，春霜廣泛分布於(yu) 中國約85%的冬小麥種植麵積 (黃淮海地區、東(dong) 北地區、長江中下遊地區、^西南地區等) 。通常發生在小 麥未成熟穗期和早穗出苗期的3、4月。冬季階段小麥等作物需要低溫來完成春化，在早期的營養(yang) 條件下可在低溫條件下存活。春季到來，大部分作物如冬小麥、茶樹等開始處於(yu) 生長階段。此時，作物對於(yu) 霜害和土壤凍脹更為(wei) 敏感。

圖 2：我國主要的冬小麥種植區

對於(yu) 經濟作物，以茶樹為(wei) 例， 目前我國的茶樹種植主要集中在江南地區。[1] 由於(yu) 特早芽、早芽茶樹的推廣，春茶芽葉萌發提前，更容易受到早春霜凍的危害。

根據實際情況，浙南 2 - 4 月最低氣溫不高於(yu) 4 ℃ (近地麵氣溫可達 0℃以下) 時，即發生茶樹春霜凍。近十年來，浙南地區的茶樹種植受春霜凍的影響較大。據統計，2013年4月上旬的低溫霜凍害，造成浙江省名優(you) 茶產(chan) 量損失1140t，直接經濟損失約 7.2 億(yi) 元。

目前，人們(men) 主要采用熏煙法、灌溉法、 噴霧法等物理方法防治凍害，大量地撒鹽也能防治土壤結冰，但是對環境不友好。尚無更加方便、快捷、環境友好的防治措施。因此，如何解決(jue) 南方地區暫時性氣象災害造成的土壤凍脹、作物減產(chan) 等問題，是我們(men) 研究的主要目的。

2.抗凍蛋白的選擇

（1）抗凍蛋白AFPs的作用機理

根據目前掌握的資料和實際情況，我們(men) 主要將目光聚焦到了解決(jue) 土壤霜凍問題上。首先，我們(men) 需要找到對應的功能蛋白，我們(men) 主要選擇抗凍蛋白 (AFPs) 作為(wei) 功能蛋白。其主要通過熱滯後的形式發揮功能，熱滯後指的是水熔點與(yu) 凝固點之間的差值，AFPs 通過對冰表麵的覆蓋作用，發揮熱滯後效應。

對於(yu) 抗凍蛋白的選擇，通過查閱資料發現，昆蟲 AFP 的 TH 值最高，為(wei) 3-6°C ，因此，我們(men) 率先尋找耐寒昆蟲中的抗凍蛋白，並把它導入到工程菌中。

（2）TmAFP

關(guan) 於(yu) 昆蟲的抗凍蛋白，找到了一種來自於(yu) 甲蟲 Tenebrio molitor 的抗凍蛋白TmAFP。[2]TmAFP 作為(wei) 一種過度活躍的 AFP，其熱滯後約為(wei) 魚類 AFP 的 10 -100 倍。

其分泌的 TmAFP 含有一個(ge) 冰結合位點 (IBS) ，可使 TmAFP 不可逆地結合在冰表麵，造成冰隻能在 AFP 之間生長，冰麵曲率變大。根據吉布斯-湯姆遜效應，冰麵曲率增大將造成凝固點的降低，通過阻止小冰晶聚合成大冰晶，防治土壤的膨脹造成根係細胞膜的破裂，緩解土壤凍脹帶來的危害。

（3）TmAFP-Mfp 嵌合蛋白

值得一提的是，目前人們(men) 還研製出將 TmAFP 和來自貽貝的粘附蛋白 Mfp 組合在一起，構建 TmAFP-Mfp 嵌合蛋白 (將 Mfp 結合到防凍蛋白的 C 端) [3] 。並對它的吸附能力進行對比試驗，結果顯示，TmAFP-Mfp 顯示出了更強的吸附作用，也可較強地抑製水結冰與(yu) 冰晶的聚合。

同時，TmAFP-Mfp 嵌合蛋白也顯示出了較強的生物相容性和可忽略的細胞毒性。但是，與(yu) TmAFP 相比，嵌合蛋白的熱滯後溫度 TH 較低，最高僅(jin) 為(wei) 0.18°C。

就結冰延遲時間而言，隨著嵌合蛋白濃度的增加，延遲時間也增加，在實驗室模擬實驗中，包被 80 mg/mL Mfp-AFP 的水滴可被冷凍延遲至 154 s。

圖 3： 

(A) 溶液中 TH 間隙內(nei) 溫度下的冰生長情況

(B) PBS 和 Mfp-AFP 不同熱滯後溫度下對應的冰生長速率 

(C) 利用顯微圖像顯示不同濃度的 Mfp-AFP 的冰晶形態 

(D) 30 分鍾時冰晶 MLGS 的定量分析

除了 TmAFP ，還有許多其它種類的抗凍蛋白，在體(ti) 外試驗中也顯示出了較好的效果，如來自加拿大的 Dendroides 甲蟲分泌的 AFPsDAFP1 以及其它生物如 魚類、真菌等分泌的抗凍蛋白等。  

3.低溫誘導啟動子——溫度選擇開關(guan) ：COR15a

在選擇好特定的抗凍蛋白後，後續我們(men) 還需進行溫度選擇開關(guan) 的控製，使得在土壤溫度下降的過程中實現抗凍蛋白的表達，當土壤開始結冰時，抗凍蛋白已經表達完全，發揮作用。

[1] [2] 目前已經分離出了多種低溫誘導啟動子，在這些啟動子中，來自於(yu) 擬南芥的 COR15a 和 RD29A 啟動子是最常用的。

[4] 通過植物內(nei) 檢測係統，發現 COR15a 啟動子活性在 2°C  下通過晝夜循環增強，而在 8 °C 或更高的黑暗中突然抑製其誘導。

[5] COR15a 與(yu) 光周期相關(guan) ，受晝夜循環的影響，根據文獻閱讀可知，COR15a 啟動子的活性通常在光照時逐漸增強，並在第一個(ge) 晝夜循環中的黑暗條件下活性達到峰值，並在次日光照是繼續積累。而在明顯缺光的環境中，COR15a 啟動子的活性較低，誘導水平不理想。

由於(yu) 我們(men) 要將攜帶有低溫誘導啟動子和抗凍蛋白質粒的共生菌並投入植物根部。啟動在在共生菌中的表達能力還需進一步探究，且土壤的透光率也會(hui) 影響啟動子的表達。

個(ge) 人評價(jia) ：

這一周的文獻閱讀我主要聚焦在背景調研、抗凍蛋白、低溫誘導啟動子三個(ge) 方麵。

在背景調研上，我們(men) 主要研究的是暫時性凍土造成南方地區的作物減產(chan) 問題，目前尚無良好的解決(jue) 方案。在抗凍蛋白的選擇上，我主要查閱了昆蟲攜帶的抗凍蛋白 TmAFP，並進一步探究，找到了一種 TmAFP-Mfp 嵌合蛋白， 可將 AFP 有效地吸附在冰麵上發揮作用。

在低溫誘導啟動子的尋找上，我主要找到了來自於(yu) 擬南芥的低溫誘導啟動子COR15a。它在低溫情況下可活化並激活下遊基因的表達，但由於(yu) 它的調控受到晝夜循環 (光周期) 的影響，我們(men) 在土壤中 是否能檢測到規律的光周期仍需要進一步探索。這一周我們(men) 明確了研究目的、研究對象，也了解我們(men) 整個(ge) 進階的過程。

參考文獻：

[1]Ambroise V, Legay S, Guerriero G, Hausman JF, Cuypers A, Sergeant K. The Roots of Plant Frost Hardiness and Tolerance.  Plant  Cell   Physiol.   2020 Jan 1;61(1):3-20.  doi:10. 1093/pcp/pcz196.   PMID:   31626277;   PMCID:PMC6977023.

[2]Shaoli  Cui,  Weijia  Zhang,  Xueguang  Shao,  and  Wensheng  Cai Hyperactive  Antifreeze  Proteins Promote Ice Growth before Binding to It Journal of Chemical Information and Modeling 2022 62 (21), 5165-5174 DOI: 10.1021/acs.jcim.1c00915

[3]Gao  Y,  Qi  H,  Fan  D, Yang J,  Zhang  L.  Beetle  and  mussel-inspired  chimeric  protein  for fabricating anti-icing coating. Colloids Surf B Biointerfaces. 2022 Feb;210:112252. doi : 10.1016/j.colsurfb.2021.112252 . Epub 2021 Nov 27. PMID: 34902712.

[4]Li J, Qin  R, Xu  R,  Li  H, Yang Y, Li L, Wei P, Yang J. Isolation and identification of five cold-inducible promoters from Oryza sativa. Planta. 2018 Jan;247(1) :99-111. doi : 10.1007/s00425-017-2765-x. Epub 2017
Sep 6. PMID: 28879616.

[5]Yoko Tominaga, Kensaku Suzuki, Matsuo Uemura, Yukio Kawamura, In Planta Monitoring of Cold-Responsive Promoter Activity Reveals a Distinctive Photoperiodic Response in Cold Acclimation, Plant and Cell Physiology, Volume 62, Issue 1, January 2021, Pages 43–52,