文獻分享 Biosesafe：遺傳生物遏製係統——綜述

文獻標題：Genetic Biocontainment Systems for the Safe Use of Engineered Microorganisms Journal：Biotechnology and Bioprocess Engineering

網址：https://doi.org/10.1007/s12257-020-0070-1

關(guan) 鍵詞：合成生物學；生物容器；轉基因生物；營養(yang) 缺陷；異源生物學

主要內(nei) 容：

本綜述介紹控製微生物增殖和遺傳(chuan) 材料釋放的生物封閉係統，主要側(ce) 重於(yu) 消除細胞和 DNA 的遺傳(chuan) 手段。用具有代表性的例子概述了每個(ge) 生物封閉係統，強調了其優(you) 缺點。還討論了遺傳(chuan) 生物遏製係統為(wei) 實際用途而應克服的未來挑戰。

一、針對菌株

（一）營養(yang) 缺陷

限製工程微生物增殖的最簡單方法之一是使用參與(yu) 氨基酸或核酸生物合成途徑的必需基因。通過刪除不同的必需基因並補充必需基因合成的營養(yang) 素，我們(men) 可以使工程細胞的生長依賴於(yu) 營養(yang) 素。這種微生物依賴特定營養(yang) 物質的生物遏製係統稱為(wei) 營養(yang) 缺陷型生物遏製係統。營養(yang) 缺陷型生物防護係統可使用不同類型的營養(yang) 物質，包括核苷、亞(ya) 磷酸鹽和 CO₂。

舉(ju) 例：

（1）將來自乳酸乳球菌的腺苷酸合酶基因 thyA 替換為(wei) 人 IL10 基因以產(chan) 生腺苷酸營養(yang) 缺陷型。

（2）消除在乳酸乳球菌中編碼 CTP 合酶的 pyrG 基因，以獲得胞嘧啶營養(yang) 缺陷型。

（3）消除大腸杆菌菌株中的所有磷酸鹽和有機磷酸鹽轉運蛋白，並引入了亞(ya) 磷酸鹽轉運蛋白 HtxABCDE 。在該係統中，細胞隻有在外源供應無機磷酸鹽時才能存活。當在細胞內(nei) 構建亞(ya) 磷酸鹽-營養(yang) 缺陷型生物圍護係統時，21天未觀察到逃逸突變體(ti) ，表明宿主細胞繞過生物圍護係統概率的逃逸頻率為(wei) 1.94×10^-13 。

（4）藍藻聚球藻中的羧基體(ti) 殼蛋白缺陷，使細胞依賴於(yu) 高 CO₂ 濃度。在水生係統中，CO₂ 濃度很低，因此 CO₂ 濃縮機製對於(yu) 增加局部 CO₂ 濃度使其足以讓細胞存活至關(guan) 重要。羧基體(ti) 殼蛋白的缺失中斷了 CO₂ 濃縮機製，從(cong) 而損害了藍藻的生長。當供應至少 5% 的 CO₂ 時，高 CO₂ 依賴PCC7002 菌株存活，並且該菌株在大氣（~0.04% 的 CO₂）中的存活率小於(yu) 5×10^-10 。

優(you) 點：

使用現成的小分子作為(wei) 生存信號分子，穩健性、可操作性強。

缺點：

營養(yang) 缺陷型生物防護係統有幾個(ge) 固有的局限性。由於(yu) 工程微生物的生長完全依賴於(yu) 必需的營養(yang) 素，如果同一環境中的其他生物體(ti) 提供必需的營養(yang) 素，生物防護係統可能會(hui) 失效；使用含有所有可能的必需營養(yang) 素的豐(feng) 富培養(yang) 基可以使營養(yang) 缺陷型生物防護係統失效；營養(yang) 物的穩定性可能是在指定環境中維持工程微生物的關(guan) 鍵因素。

最後，由於(yu) 營養(yang) 缺陷係統隻控製細胞的增殖，而不控製遺傳(chuan) 物質，因此它不能阻止在開放環境中通過水平基因轉移 (HGT) 釋放遺傳(chuan) 物質。

（二）基於(yu) 條件誘導

另外，去除編碼必需營養(yang) 素合成酶的必需基因通常會(hui) 導致宿主細胞生長遲緩。這種情況下，充足的營養(yang) 供應對於(yu) 維持細胞生長變得非常重要。有條件地抑製必需基因表達不是永久刪除必需基因，則是可以替代營養(yang) 缺陷型生物防護係統。為(wei) 實現這一目標，研究人員一直在使用誘導型啟動子和這些啟動子的組合來調節必需基因的表達。

舉(ju) 例：

（1）使用誘導型啟動子來調節釀酒酵母中編碼組蛋白的必需基因。分別引入了半乳糖和雌二醇誘導型啟動子 PGAL1 和 PGAL7。 PGAL1 和 PGAL7 啟動子通過調節組蛋白 H3 基因 (HHTS) 和組蛋白 H4 基因 (HHFS) 來控製釀酒酵母的細胞生長。係統的逃逸頻率小於(yu) 10^-10 。阿格蒙等人。

（2）使用雌二醇誘導型合成 SPAL 啟動子來控製幾個(ge) 必需基因（FAS2、HTS1、RPB11、SEC17 和 SEC4），係統的逃逸頻率約為(wei) 10^-8 。

（3）除了生存信號的外源性補充外，內(nei) 源性分子可以作為(wei) 提示分子來激活必需基因的表達。使用群體(ti) 感應分子酰基高絲(si) 氨酸內(nei) 酯 (AHL)，其濃度隨著細胞密度的增加而增加，以驅動抗生素抗性基因表達。（是不是可以考慮使用在幹旱條件下或者寒冷條件下細菌自己產(chan) 生的某種物質去誘導存活基因，當脅迫因素消失時，該種內(nei) 源物質消失，細菌死亡。） 結果，高濃度的宿主激活了抗生素抗性基因，使宿主細胞得以存活。然而，在低濃度下，不會(hui) 誘導抗生素抗性基因，導致細胞死亡。

（4）對五個(ge) 必需基因（pheS、dnaN、tyrS、metG 和 adk）進行定向進化，以產(chan) 生苯並噻唑依賴性必需酶。在苯並噻唑存在的情況下，細胞可以正常生長，但在沒有苯並噻唑的情況下，必需的酶會(hui) 失去活性，導致細胞死亡。2個(ge) 必需基因的組合顯示出 5×10^-10 的逃逸頻率，3個(ge) 必需基因的組合進一步將逃逸頻率降低到 3×10^-11 的檢測限以下。研究人員沒有操縱啟動子區域，而是產(chan) 生了對必需酶的配體(ti) 依賴性，並將配體(ti) 用作生存信號。

優(you) 點：

係統易克隆，基於(yu) 條件必需性的生物遏製係統僅(jin) 依賴於(yu) 指定的誘導劑及其相應的啟動子，此功能允許係統以最小的改動擴展到不同的宿主菌株。此外，由於(yu) 在環境中很少發現指定的誘導劑，因此基於(yu) 條件必要性的生物防護係統沒有交叉喂養(yang) 問題。

缺點：

基於(yu) 條件必要性的生物防護係統無法在開放環境中防止 HGT。

（三）基於(yu) 毒素

典型的基於(yu) 毒素的生物防護係統旨在表達毒素以響應指定未經授權條件的信號分子，從(cong) 而導致細胞死亡。

舉(ju) 例：

（1）構建一個(ge) 基因表達盒，將 hok 表達為(wei) 響應大腸杆菌中色氨酸耗竭的毒性基因。當培養(yang) 基中的色氨酸耗盡時，會(hui) 合成毒素 hok，破壞細菌細胞膜，導致細胞死亡。施韋德等人。設計了一個(ge) 類似的係統負責大腸杆菌中的磷酸鹽消耗。同樣，Contreras 等人。使用 gef 作為(wei) 有毒基因，並設計了導致大腸杆菌中苯甲酸鹽消耗的遺傳(chuan) 回路。這種依賴苯甲酸鹽的生物防護係統是為(wei) 設計用於(yu) 從(cong) 環境中去除汙染物苯甲酸鹽的細胞而構建的。當細胞降解所有苯甲酸鹽時，生物防護係統會(hui) 激活 gef 的表達並抑製宿主細胞的生長，自動將整個(ge) 種群從(cong) 環境中移除。此外，在依賴苯甲酸鹽的生物防護係統中使用兩(liang) 個(ge) 拷貝的 gef 基因提高了工程大腸杆菌和惡臭假單胞菌的殺滅效率。設計了來自 Streptomyces avidinii 的致死鏈黴親(qin) 和素基因的表達，以響應惡臭假單胞菌中 3-甲基苯甲酸鹽的消耗。

（2）構建了一個(ge) 基因表達盒，可檢測釀酒酵母中的低水平葡萄糖並允許表達有毒的 relE 基因。同樣，Balan 等人。用來自釀酒酵母中粘質沙雷氏菌的致死核酸酶基因構建了一個(ge) 低葡萄糖反應回路。

（3）使用溫度依賴性轉錄抑製因子 TlpA36 來調節抗毒素 CcdA，但表達毒素 CcdB 不受調節。TlpA36 在低溫（< 30^oC）下抑製 TlpA 啟動子的轉錄並降低抗毒素 CcdA 的表達，導致細胞死亡。（反過來想，將TlpA放在Ccd前麵，低溫時抑製毒素的表達，高溫時上調，細胞死亡。就是這個(ge) 溫度閾再低點就好了15^oC左右）斯特林等人使用冷休克蛋白 A (PcspA) 的溫度敏感調節區來調節毒性基因 CcdB。調節區的長 5' UTR 在低溫（< 22^oC）下激活翻譯，形成穩定的結構，允許 CcdB 的高表達。

優(you) 點：

該係統可以通過毒素主動誘導細胞死亡，並且設計起來相對簡單。

缺點：

毒性基因通常會(hui) 導致細胞生長遲緩，因此應嚴(yan) 格控製毒素的表達。此外，有毒基因的隨機突變會(hui) 導致生物防護係統功能喪(sang) 失。

（四）多種殺傷(shang) 機製的組合

由於(yu) 營養(yang) 缺陷型係統、基於(yu) 條件必需性的係統和基於(yu) 毒素的係統具有明顯的缺點，因此許多研究試圖將它們(men) 結合起來以提高生物防護性能。聯合生物防護係統通常是有益的，因為(wei) 它們(men) 可以降低使生物防護係統失效的致命突變的可能性。

舉(ju) 例：

（1）通過將基於(yu) 毒素的係統與(yu) 基於(yu) 條件必要性的係統相結合，開發了一種高性能的生物防護係統。首先引入 3-甲基苯甲酸誘導型啟動子以抑製 P. putida 中編碼毒素的 gef 基因的表達。然而，該係統僅(jin) 在土壤環境中表現出較弱的殺傷(shang) 效率和相對較高的逃逸頻率（10^-8）。然後，將其與(yu) 基於(yu) 條件必要性的係統相結合。從(cong) 染色體(ti) 中去除了必需基因 asd，並用 3- 苯甲酸甲酯誘導型啟動子重新插入了 asd 基因。這樣一來細胞生長依賴於(yu) 3-甲基苯甲酸酯的供應。通過結合對 gef 的抑製和對 asd 的誘導以響應 3-甲基苯甲酸酯，逃逸頻率降低到 10^-9 的檢測限以下。

（2）使用編碼核酸內(nei) 切酶的 EcoRI 作為(wei) 致死基因，使用肽聚糖生物合成途徑的 MurC 作為(wei) 目標必需基因。為(wei) 了控製 MurC，一種稱為(wei) mf-Lon 的靶向蛋白質降解係統被用來特異性降解必需的 MurC 酶。這些殺傷(shang) 機製與(yu) 合成基因電路相結合，創造了 Deadman 和 Passcode 微生物殺傷(shang) 開關(guan) 。Deadman 殺傷(shang) 開關(guan) 基於(yu) 不平衡的交叉調節轉錄調節因子，tetR 和 lacI，以及一種特定的誘導分子，ATc 被用作生存信號。在去除 ATc 後，兩(liang) 種殺傷(shang) 機製都被激活，導致細胞死亡。Passcode kill switch 基於(yu) 混合轉錄因子來靈活地改變生存信號的組合。通過誘導劑分子（包括 IPTG、半乳糖和纖維二糖）的正確組合，EcoRI 的表達和 MurC 的降解受到抑製，因此細胞得以存活。對於(yu) 所有其他組合，密碼電路觸發了細胞死亡的兩(liang) 種殺傷(shang) 機製。該係統將細胞活力降低到 10^-7 的檢測限以下。（之前有考慮看過這篇文獻，但是由於(yu) ATc（脫水四環素）直接放在土壤中會(hui) 在程土壤微生物群的紊亂(luan) ，便覺得不適合我們(men) 的課題。）

 
圖1：Deadman
  
圖2：Passcode

（3）結合所有三種殺傷(shang) 機製，營養(yang) 缺陷型係統、基於(yu) 條件誘導係統和基於(yu) 毒素的係統。刪除用於(yu) 生物素營養(yang) 缺陷型的 bioAB、毒性基因 EcoRI 的整合以及必需基因（ribA、nadE、glmS 和 gmk）盒與(yu) 誘導型啟動子（PLtetO、PLlacO、PARa 和 PRha）的重建導致逃逸頻率低於(yu) 1.3×10^-12 。

優(you) 點：

不同生物防護策略的組合通常顯示出較低的逃逸頻率和更高的殺傷(shang) 效率。因此，該策略可用於(yu) 限製微生物的傳(chuan) 播，特別是對於(yu) 需要抗釋放遺傳(chuan) 係統的轉基因生物。

缺點：

仍然存在對工程微生物在細胞死亡後可能釋放的遺傳(chuan) 物質的擔憂。因此，需要額外的保護措施來充分保護遺傳(chuan) 材料或防止釋放。

二、針對遺傳(chuan) 物質

（一）基於(yu) 毒素-抗毒素的質粒保護係統。

舉(ju) 例：

（1）將編碼大腸杆菌素 E3 的毒性基因置於(yu) 質粒上，將大腸杆菌素免疫基因置於(yu) 染色體(ti) 上。染色體(ti) 中含有免疫基因的微生物可以複製質粒。如果天然存在的微生物接受了錯誤釋放到開放環境中的質粒，則該質粒會(hui) 激活大腸杆菌素 E3 並導致受體(ti) 細胞死亡。

（2）使用 EcoRI 和 EcoRIM 作為(wei) 毒素-抗毒素對構建質粒保護係統。為(wei) 實現這一目標，他們(men) 將 EcoRI 基因置於(yu) 質粒上，而將編碼 EcoRI 甲基化酶的 EcoRIM 基因置於(yu) 染色體(ti) 上。這樣，不含 EcoRIM 基因的細胞在接受含有 EcoRI 基因的質粒時無法存活。進一步構建一個(ge) 改進的係統，結合之前的兩(liang) 個(ge) 毒素-抗毒素對。將編碼大腸杆菌素E3和EcoRI的基因整合到質粒中，將編碼免疫E3和EcoRI甲基化酶的基因插入染色體(ti) 。

優(you) 點：

毒素-抗毒素係統將有助於(yu) 確保構建在質粒上的遺傳(chuan) 物質免受水平基因轉移。

缺點：

由於(yu) 該係統依賴於(yu) 毒素，毒素的異常表達可能導致細胞生長遲緩，並且毒素隨機突變的高概率可以使保護係統失效。

（二）基於(yu) 條件複製起點

條件複製起點 ColE2-P9 需要起始蛋白 Rep 來複製質粒 DNA。沒有 Rep，宿主細胞無法複製含有 ColE2-P9 來源的質粒。將編碼 Rep 蛋白的基因插入宿主染色體(ti) 允許質粒在宿主細胞中複製，除了條件質粒外，可以再整合毒素-抗毒素係統或者營養(yang) 缺陷機製以提高遺傳(chuan) 物質的安全性。

優(you) 點：

與(yu) 前麵抗毒素係統相比，這個(ge) 不會(hui) 造成工程菌的生長抑製。

（三）基於(yu) CRISPR-Cas

基於(yu) CRISPR-Cas 的係統可以在基因水平上以序列特異性方式保護遺傳(chuan) 物質，即使目標基因位於(yu) 染色體(ti) 上也是如此。CRISPR-Cas 係統識別目標序列並對其進行內(nei) 源性切割。此功能用於(yu) 在可能發生未經允許的釋放的情況下分解目標基因。

卡連多等人。開發了一種靶向 DNA 降解裝置，該裝置基於(yu) IE 型 CRISPR 係統。作為(wei) 對阿拉伯糖誘導的響應，該係統降解了由向導 RNA 引導的目標序列。當目標序列在質粒上時，它顯示出相對較低的失敗率（10^-8）。另一方麵，當目標基因位於(yu) 染色體(ti) 上時，該係統會(hui) 導致宿主細胞死亡，逃逸率為(wei)

10^-8。

優(you) 點：

由於(yu) CRISPR-Cas 係統通常對目標序列具有高度特異性，因此基於(yu) CRISPR 的生物防護電路具有最小的副作用並且對細胞生長的影響可以忽略不計。此外，該係統活躍穩定，兩(liang) 個(ge) 月後仍可正常運行，體(ti) 現了係統的長期穩健性。

三、具有異種生物成分的生物防護係統

異種生物學側(ce) 重於(yu) 使用 DNA、RNA 和氨基酸的非規範替代品或類似物的新生物係統。用於(yu) 生物遏製的異種生物學方法探索獨立運行且很少與(yu) 自然生物係統相互作用的正交生物係統的發展。例如，非規範氨基酸 (NCAA) 、非標準堿基對和具有新型糖主鏈的核酸（異種核酸，XNA）存在於(yu) 自然界中的物質被用作開發生物防護係統的基石。

與(yu) 異種生物成分一起，複製、轉錄或翻譯機製被直接進化為(wei) 使用異種生物構建塊。而自然存在的係統無法有效地整合異種生物成分這種複製、轉錄和翻譯遺傳(chuan) 密碼的障礙可用於(yu) 構建用於(yu) 菌株和基因保護的新型生物防護係統。

（1）曼德爾等使用大腸杆菌 C321.ΔA 菌株，在該菌株中，他們(men) 為(wei) amber終止密碼子分配了一個(ge) 非規範氨基酸 L-4,4'-聯苯丙氨酸 (bipA) 。通過對必需酶（Adk、AlaS、MetG、Pgk 和 TyrS）的計算重新設計，他們(men) 將非規範 bipA 分配給必需酶的關(guan) 鍵殘基，從(cong) 而賦予工程菌株合成 bipA 依賴性。（需要bipA才能合成必需酶，如果質粒發生轉移自然生物也不能也不能利用）通過這種方式，他們(men) 可以實現逃逸頻率明顯低於(yu) 10^-11 。

（2）此外，帶有非天然堿基的 DNA 被用來控製宿主菌株的活力。馬裏埃等人。進化大腸杆菌創造了一種新菌株，可以用 5-氯尿嘧啶替代胸腺嘧啶。破壞 thyA 基因產(chan) 生胸腺嘧啶營養(yang) 缺陷型菌株，該菌株進一步進化為(wei) 在 DNA 中摻入 5-氯尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。因此，工程菌株由 A、G、C 和 5-氯尿嘧啶組成，並且隻能在 5-氯尿嘧啶存在的情況下存活。

優(you) 點：

通過將琥珀密碼子重新分配給 NCAA 而產(chan) 生的合成營養(yang) 缺陷型設計了僅(jin) 依賴於(yu) NCAA 存在的菌株生物防護係統。該係統表現出出色的逃逸頻率，使其成為(wei) 以消除工程化細胞為(wei) 首要任務的應用的理想選擇。

由於(yu) 自然界中不存在 NCAA，因此依賴 NCAA 的生物防護係統可以避免營養(yang) 缺陷型生物防護係統和基於(yu) 條件必要性的生物防護係統在開放環境中可能遇到的交叉喂養(yang) 問題，限製工程材料在自然環境中的傳(chuan) 播，自然環境中的活生物體(ti) 無法複製或轉錄由工程化的非天然堿基對和 XNA 組成的序列。當遺傳(chuan) 物質水平轉移時，此功能可防止該基因在其他生物體(ti) 中發揮作用。

缺點：

異種基因保護仍處於(yu) 起步階段，由於(yu) 尚未研究 NCAA 的生物相容性，因此在開放環境中使用 NCAA 仍然令人擔憂。