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文獻標題：

Constructing E.coli Co-Cultures for De Novo Biosesynthesis of Natural Product Acacetin

DOI號：

https://doi.org/10.1002/biot.202000131

關(guan) 鍵詞：

微生物共培養(yang) ；異源生物合成；從(cong) 頭合成

內(nei) 容摘要：

模塊化共培養(yang) 工程是複雜天然產(chan) 物生物合成的新興(xing) 方法。在這項研究中，構建了分別由兩(liang) 種和三種大腸杆菌菌株組成的微生物共培養(yang) 物，用於(yu) 從(cong) 簡單的碳底物葡萄糖中從(cong) 頭生物合成 Acacetin。為(wei) 此，異源生物合成途徑被分為(wei) 不同的模塊，每個(ge) 模塊都容納在專(zhuan) 用的大腸杆菌菌株中進行功能表達。在優(you) 化組成菌株之間的接種率後，與(yu) 單一培養(yang) 對照相比，工程共培養(yang) 物的產(chan) 量提高了4.83倍，在搖瓶中培養(yang) 三株共培養(yang) 物會(hui) 在48小時後產(chan) 生20.3 mgL⁻¹Acacetin。

主要內(nei) 容：

1.雙菌株共培養(yang) 設計

構建了兩(liang) 個(ge) 大腸杆菌菌株PU1和BD1，分別包含上遊和下遊通路模塊，並在一個(ge) 合並培養(yang) 物中共培養(yang) ，上遊模塊包含工程化的酪氨酸途徑和酪氨酸氨裂解酶TAL，用於(yu) 將葡萄糖轉化為(wei) p-Coumaric acid。下遊模塊包含一係列異源酶，包括4CL、CHS、CHI、MatB、MatC、FNSI和PaCOMT，用於(yu) 將p-Coumaric acid轉化為(wei) Acacetin。上遊和下遊菌株之間的接種比例從(cong) 1:1到1:19不等，以平衡相應通路模塊的生物合成能力。

圖1 A:雙菌株係統模式圖 B:PU1:BD1不同接種比例下中間產(chan) 物和終產(chan) 物的含量變化

上遊菌株PU1的高接種百分比有利於(yu) 途徑中間體(ti) p-Coumaric acid的提供，但它抑製了下遊菌株的亞(ya) 群和生物轉化能力。結果，觀察到相對高的p-Coumaric acid積累。另一方麵，下遊菌株BD1的高接種百分比對兩(liang) 個(ge) 途徑模塊的相對生物合成強度產(chan) 生相反的影響。基於(yu) 這兩(liang) 種效應，在1:9的比例下，Acacetin的最佳產(chan) 量7.9 mgL^-1，相應的p-Coumaric acid積累量為(wei) 62.0 mgL^-1。通過將整個(ge) Acacetin途徑分別引入上遊和下遊共培養(yang) 菌株，構建了兩(liang) 個(ge) 單一培養(yang) 對照菌株MA1和MA2。結果發現，在相同的培養(yang) 條件下，MA1和MA2僅(jin) 分別產(chan) 生 1.2和2.7 mgL^-1Acacetin。單一培養(yang) 對照和共培養(yang) 之間的生產(chan) 差異清楚地證明了模塊化共培養(yang) 工程對天然產(chan) 物生物合成的能力。

另一方麵，Naringenin和Apigenin的積累遠低於(yu) p-Coumaric acid。在1:9的最佳接種比例下，僅(jin) 檢測到10.4 mgL^-1Naringenin和0.5 mgL^-1Apigenin。該結果表明Naringenin和Apigenin的供應不足限製了共培養(yang) 係統中Acacetin的生產(chan) 。對於(yu) 雙菌株共培養(yang) ，與(yu) Naringenin和Apigenin生物合成相關(guan) 的酶促反應都被納入下遊菌株，這對菌株造成了過度壓力，並消除了平衡柚皮素提供和轉化需求的靈活性。

2.三菌株共培養(yang) 體(ti) 係

圖2

A）三菌株係統模式圖

B）四種候選中遊菌株生產(chan) 能力

C）四種候選下遊菌株的生產(chan) 能力

D）最終三菌株係統在不同接種比例下中間產(chan) 物和終產(chan) 物的含量變化

在該係統中，上遊菌株負責途徑中間體(ti) p-Coumaric acid的形成，而中遊菌株被設計用於(yu) 生產(chan) Naringenin。共培養(yang) 的下遊菌株專(zhuan) 用於(yu) 從(cong) Naringenin生產(chan) Acacetin的最後兩(liang) 個(ge) 酶促步驟。

三菌株設計進一步分散了中遊和下遊菌株之間與(yu) p-Coumaric acid到Acacetin轉化相關(guan) 的代謝負擔，還提供了一個(ge) 平台，可以更精細地平衡Naringenin 提供和轉化途徑模塊之間的生物合成能力。為(wei) 此，首先著手確定合適的菌株以分別適應中遊和下遊通路模塊。對於(yu) 中遊菌株，低丙二酰輔酶A可用性是高效Naringenin生產(chan) 的限製因素。在雙菌株共培養(yang) 係統中，引入了重組丙二酸同化途徑(MatB和 MatC)，將外源丙二酸轉化為(wei) 丙二酰輔酶A。

最近的一項研究表明，過表達脂肪酸合酶FabF會(hui) 增加細胞內(nei) 丙二酰輔酶A水平。因此構建了四種候選中遊菌株，並通過p-Coumaric acid補料實驗比較了它們(men) 的生物轉化能力。不含MatBC或FabF過表達的菌株BM1產(chan) 生21.5 mgL^-1柚皮素。僅(jin) 過表達MatBC並補充2 gL^-1丙二酸的菌株BM2產(chan) 生42.0 mgL^-1柚皮素，比BM1對照高1.95倍。單獨過表達FabF(BM3) 或與(yu) MatBC(BM4)一起過表達的產(chan) 量低於(yu) BM2，盡管其確切原因尚不清楚。

因此，選擇BM2作為(wei) 三株共培養(yang) 工程中的中遊菌株。同樣，對於(yu) 下遊菌株選擇，構建了四個(ge) 菌株，即BD2、BD3、BD4和BD5，並通過Narigenin補料實驗比較了它們(men) 將Naringenin轉化為(wei) Acacetin的能力。值得注意的是，這些菌株被設計為(wei) 具有不同的FNSI和PaCOMT表達強度，用於(yu) Acacetin生物合成。如圖2 C所示，分別從(cong) 兩(liang) 個(ge) T7啟動子表達FNSI和PaCOMT的菌株BD3顯示出最高的19.2 mgL^-1金合歡素產(chan) 量，因此被選為(wei) 三菌株共培養(yang) 的下遊菌株。

使用上麵確定的菌株，建立了PU1:BM2:BD3共培養(yang) 物，用於(yu) 從(cong) 葡萄糖生物生產(chan) Acacetin。對於(yu) 接種率優(you) 化，首先將上遊菌株的接種率分別設置為(wei) 10%、20%和30%。然後相應地改變第二個(ge) 和第三個(ge) 菌株之間的比率以平衡整個(ge) 途徑。三株共培養(yang) 的金合歡素生物生產(chan) 如圖2 D所示。當上遊菌株接種比例為(wei) 30%(6:12:2、6:2:12、6:7:7)時，相應途徑的中間體(ti) 對香豆酸產(chan) 生過量，但中遊和下遊菌株的亞(ya) 群大小和相關(guan) 的生物合成強度相對較小。導致Acacetin 產(chan) 量低。

另一方麵，過低的上遊菌株接種比例(2:12:6、2:6:12、2:9:9)導致p-Coumaric acid的供應減少，這也導致了次優(you) 的Acacetin生產(chan) 。當上遊菌株以20%(4:12:4、4:4:12、4:8:8)接種時，觀察到高Acacetin產(chan) 量。在4:12:4的接種比例下實現了12.8 mgL^-1Acacetin的最佳產(chan) 量，在4:8:8時實現了12.5 mgL^-1的類似產(chan) 量。三菌株共培養(yang) 的最高產(chan) 量比單一培養(yang) 對照的最佳產(chan) 量高4.83倍，比雙菌株共培養(yang) 高1.62倍。因此表明，可以通過合理控製接種比例來優(you) 化生物合成來解決(jue) 三個(ge) 途徑模塊之間生物合成強度的不平衡。

圖3 搖瓶培養(yang) 過程中的生長和生物合成行為(wei)

A) 共培養(yang) 細胞密度和三種菌株個(ge) 體(ti) 亞(ya) 群百分比隨時間的變

B) p-Coumaric acid、Narigenin、Apigenin和Acacetin 濃度隨時間的變化

PU1:BM2:BD3共培養(yang) 物以4:12:4的比例接種

三、搖瓶中的三菌株共培養(yang) 生物生產(chan)

為(wei) 了進一步研究生長相容性和整體(ti) 生物合成性能，通過在10 gL⁻¹葡萄糖上培養(yang) PU1:BM2:BD3進一步分析了三菌株共培養(yang) 生長和生物合成的動態接種比例為(wei) 4:12:4的搖瓶中。如圖3所示，共培養(yang) 的細胞密度隨著時間的推移而發展，並在24小時後穩定下來。4小時後，上遊菌株PU1的百分比從(cong) 20%變為(wei) 25%，並在剩餘(yu) 培養(yang) 期間穩定在21%左右。

中遊菌株BM2的種群大小在4小時後從(cong) 60%下降到48%，直到24小時保持穩定，並在培養(yang) 結束時逐漸增加到 61%。對於(yu) 下遊菌株BD3，亞(ya) 群在前12小時內(nei) 從(cong) 20%增加到29%，然後隨著時間的推移下降到培養(yang) 結束時的14%。三種菌株的生長趨勢表明，中遊菌株BM2在進入穩定期之前的生長比其他兩(liang) 種菌株慢，這主要是由於(yu) 與(yu) 該菌株中過度表達異源酶相關(guan) 的代謝負擔。

盡管如此，共培養(yang) 的菌構成總體(ti) 上僅(jin) 在相對較小的範圍內(nei) 波動。對p-Coumaric acid、Narigenin、Apigenin和Acacetin的濃度分布如圖3 B所示。結果發現，中間體(ti) p-Coumaric acid的積累在8小時內(nei) 迅速達到96.2 mgL^-1，然後逐漸下降至10 mL^-1左右，Narigenin、Apigenin的積累分別在12和36小時達到峰值。最終產(chan) 物Acacetin的濃度在前24小時內(nei) 迅速增加，表明Acacetin的生物合成發生在指數期和早期穩定期。在36小時達到20.3 mgL^-1的最高Acacetin濃度，這明顯高於(yu) 使用圖2 D所示的培養(yang) 管在5 gL^-1葡萄糖上的產(chan) 量。

個(ge) 人評價(jia) ：

該研究並未調控共培養(yang) 中的菌體(ti) 係的比例，但是最終培養(yang) 後菌構成比例區域穩定並在小範圍內(nei) 波動，且通過將代謝通路拆分給三種菌從(cong) 頭生產(chan) Acacetin 提高了產(chan) 量。