iGEM課題分享——2024 BNUZH-China

iGEM課題分享

Mangroves PE＆CO2Hunters

iGEM 2024 BNUZH-China

獲獎情況

在2024年iGEM大賽中，BNUZH-China榮獲金獎並斬獲TOP10大獎，獲得最佳生物修複課題、最佳綜合HP、最佳建模、最佳Wiki四項單項獎項的提名。

I. Background

紅樹林是生長在熱帶、亞(ya) 熱帶沿海潮間帶或河口的木本植物群落，擁有“沿海守護者”的稱號。然而，紅樹林被洋流所攜帶的大量微塑料(microplastics/MPs)汙染。

紅樹林中微塑料能吸附毒素，危害野生生物的營養(yang) 攝入，具有導致物種滅絕的隱患。港珠澳大灣區擁有超過11000公頃的紅樹林，其中微塑料的積累會(hui) 汙染水體(ti) 、危害水生生物、乃至於(yu) 危害人體(ti) 健康，因而該問題的解決(jue) 擁有重要意義(yi) ，項目 Mangroves PE&CO2 HUNTERS 也就此誕生了。

據測算，港珠澳大灣區的紅樹林中微塑料大多以PE為(wei) 主要成分，故該課題聚焦於(yu) 設計工程菌解決(jue) PE積累的問題。

圖1-1 微塑料在紅樹林土壤沉積物的垂直分布情況

圖1-2 不同區域微塑料構成

FT：福田紅樹林；QAD：淇澳島紅樹林

IN：森林內(nei) ；FR：森林邊緣

II. Design

PE降解部分 設計

首先，BNUZH-China設計了一個(ge) 組合蛋白，將建模預測獲得的PE結合肽(PE binding peptide, PEBP)和PE酶(PEase)相偶聯，通過疏水作用力和範德華力與(yu) 微塑料的作用，實現微生物在微塑料處的富集，並提高降解效果。

此外，為(wei) 了將 PEBP-PEase 固定在工程菌外膜上，他們(men) 提高 PEBP-PEase 融合蛋白與(yu) 微塑料的接觸效果，他們(men) 設計將 PEBP-PEase 錨定在外膜的自轉運蛋白(autotransporter)上。他們(men) 預測了自轉錄蛋白 estA 的 β-桶 結構和 信號肽 結構(signal peptide/SP)的分界點，將PEBP-PEase插入其中，以實現融合蛋白在外膜上的定位(圖2-1)。

圖2-1 微塑料初步降解設計

為(wei) 實現進一步的降解，BNUZH-China設計了兩(liang) 個(ge) 係統，輔助 PAO1 內(nei) 源性的代謝流程以降解PEase產(chan) 生的烷烴，形成CO2。

第一套係統構建了融合蛋白 AlkB2-Rd45-Adh(圖2-2-1)，其中膜上的羥化酶 AlkB2 能羥化直連烷烴，使之成為(wei) 醇，並轉移醇到胞質內(nei) 。但由於(yu) 單加氧反應需要氧化還原能力，為(wei) 加強反應，他們(men) 在alkB2基因後插入了Rd45，使 AlkB2 能偶聯更少的氧化還原蛋白而發揮更好的作用。

此外，Adh 作為(wei) 乙醇脫氫酶，能令 AlkB2、CYP 兩(liang) 通路產(chan) 生的醇反應成相應的酮，同時回補羥化所產(chan) 生的 NAD+ 與(yu) NADH 比例的變化，以降低對後續的內(nei) 源性代謝過程的影響。

由於(yu) AlkB2-Rd45-Adh 僅(jin) 對長鏈和中鏈烷烴有效，故又引入了 P450camY96F 酶(cypY96F基因)(圖2-2-2)，以補充對短鏈烷烴的降解能力。

圖2-2-1 AlkB2 降解係統設計

圖2-2-2 CYP 降解係統設計

圖2-3 工程菌內(nei) 後續內(nei) 源性降解

此外，考慮到工程菌的工作環境涉及土壤深層，然而 PAO1 為(wei) 好氧菌，故需提高其厭氧環境的抗性。為(wei) 實現此目的，BNUZH-China向工程菌內(nei) 導入了vbg基因，一種單結構域血紅蛋白 VHb 改造後對應基因。

改造後 VHb 能有效結合氧氣，與(yu) 終末氧化酶交互轉移 O2到呼吸鏈中，並顯著增強 NAD+ 再生能力。此外，其還與(yu) 轉錄調控因子交互，激發胞內(nei) 氧化磷酸化，促進內(nei) 源性降解過程。

圖2-4 深層降解設計

CO2傳(chuan) 遞部分 設計

為(wei) 了提升菌株降解能力，同時希望能夠處理二氧化碳溢出的現象，BNUZH-China 打算以沼澤紅假單胞菌為(wei) 底盤，設計另一個(ge) 固碳工程菌。而如何連接這兩(liang) 個(ge) 工程菌的物質交換成為(wei) 了關(guan) 鍵問題。

為(wei) 了解決(jue) 該問題，BNUZH-China希望通過促進細胞外電子轉移(EET）提升其電子傳(chuan) 遞能力，提高 CO2轉換為(wei) 碳酸氫根的比例，促進兩(liang) 類菌之間的碳元素傳(chuan) 遞。

具體(ti) 而言，他們(men) 以 PAO1 為(wei) 底盤設計了一個(ge) 優(you) 化設計的表達高導電性菌毛的基因 PaPilA1–61M3 ，同時將 nqrf 基因(促進吩嗪的還原，以促進能量產(chan) 生和質子動力的建立)上調，以優(you) 化電子傳(chuan) 遞效果，提高兩(liang) 菌間傳(chuan) 遞碳元素的能力。

同時，他們(men) 選擇將多拷貝的 psCA1 基因(PAO1 內(nei) 源基因，表達物催化 CO2轉化為(wei) 碳酸酐)轉入 PAO1，並設計通過內(nei) 源性的 BicA 將碳酸酐轉運出 PAO1。

此外，他們(men) 設計利用 CGA009 內(nei) 源性的 ABC 轉運蛋白，將碳酸酐轉入細胞內(nei) ，再用多拷貝形式上調編碼 α-CAs 的 acaP 基因，提高碳酸酐轉化為(wei) CO2的速率，然後利用 CGA009 內(nei) 源性的 Rubisco 酶和 CBB(Calvin-Benson-Bassham)循環固定 CO2為(wei) 纖維素。

圖2-5 碳元素傳(chuan) 遞部分設計

CO2固定部分設計

葡萄糖作為(wei) 細菌纖維素的前體(ti) ，其合成需要3-磷酸甘油醛，而胞內(nei) NADPH 水平限製了 R. palustris CGA009 通過卡爾文循環生成3-磷酸甘油醛的效率。由於(yu) 卡爾文循環受 NADPH 和 NADP+ 濃度製約，因此，提高胞內(nei) NADPH 和 NADP+ 水平的合成生物學策略對提高卡爾文循環效率具有重要意義(yi) (圖2-6)。為(wei) 提高CO2固定效率，BNUZH-China設計了如下四個(ge) 模塊：

一、NAD+ 的從(cong) 頭生物合成。缺乏 NAD+ 可能會(hui) 對 R. palustris CGA009 造成不利影響。NMN是其重要前體(ti) ，引入編碼基因 nadK，以直接將 NMN 轉化為(wei) NAD+，避免 NAD+的損耗。

二、NADP+ 的生物合成。為(wei) 了提高 NADP+ 的合成，引入了 R. palustris RCB100 中編碼 NADK(NAD 激酶)的nadK基因。

三、促進NADPH的轉化。為(wei) 提高 NADP+ 轉化為(wei) NADPH 的初始速率，引入E. coli MG1655 中編碼 PntAB 的基因pntA和pntB(圖2-7)。

四、增加固碳量。通過增加纖維素含量可以實現生物固碳含量的上升。 BcsA 和 BcsB 是負責纖維素鏈合成的核心催化子單元。因此，該課題通過從(cong) Pseudomonas pactida NBRC 14164 中獲取bcsa和bcsb基因來增強纖維素的合成。

圖2-6 固碳流程圖

圖2-7 工程菌內(nei) NADPH 生物合成通路

自殺係統設計

在生物安全方麵，BNUZH-China通過hok/sok這一毒素-抗毒素係統，實現完成任務後自殺的效。其中，hok是致毒基因，mok是生成hok的引導肽，sok是能夠表達一種小反義(yi) RNA 的抗毒基因，該 RNA 與(yu) mok RNA 結合會(hui) 導致複合物被降解，使得mok無法表達，從(cong) 而無法產(chan) 生 hok 毒素蛋白。

同時sok由強啟動子驅動，而hok/mok由弱啟動子驅動，正常細胞中由於(yu) sok反義(yi) RNA 數量較多，使得毒素無法表達故而存活(圖2-8)。

圖2-8 hok/sok係統工作原理

為(wei) 防止該質粒丟(diu) 失，通過sok與(yu) mok的 RNA不同的降解速率來實現。由於(yu) sok反義(yi) RNA 的降解速率遠快於(yu) mok RNA，假設工程菌的質粒意外丟(diu) 失，而hok/sok係統無法表達，細胞中剩餘(yu) 的 mok RNA 在 sok反義(yi) RNA 降解後依然表達殺死細菌(圖2-9)。

此外，由於(yu) 預期的工程菌是在紅樹林環境中發揮作用，而紅樹林周邊有高濃度的檸檬酸鹽，故可以根據感知檸檬酸鹽的濃度作為(wei) 判斷工程菌是否離開紅樹林環境的標準。因此，他們(men) 使用了來自 opdH-tctCBA-tctDE 操縱子係統的啟動子 PopdH作為(wei) sok的啟動子。

當周邊環境中沒有檸檬酸鹽時，來自 opdH-tctCBA-tctDE 操縱子係統的 tctD 會(hui) 特異性地結合到 PopdH上並抑製其活性；然而，當檸檬酸鹽存在時，tctD 會(hui) 與(yu) 檸檬酸鹽結合，不再抑製啟動子，啟動子正常表達，工程菌可正常存活(圖2-10)。

圖2-9 hok/sok係統應用於(yu) 防止質粒丟(diu) 失

圖2-10 hok/sok係統應用於(yu) 檢測檸檬酸濃度

III. Result

PE降解 功能驗證

BNUZH-China 將表達alkB2-Rd45-adhA融合蛋白、表達cypY96F和vgb的兩(liang) 類工程菌分別放於(yu) 含微塑料環境中培養(yang) 七天，發現微塑料質量變化相對野生型PAO1對照組都僅(jin) 小0.004g，變化微小。

但經FT-IR檢測(圖3-1)，發現實驗組相對對照組微塑料的PE相關(guan) 化學鍵信號強度降低，說明確實存在降解過程。

又經SEM掃描電子顯微鏡觀察微塑料顆粒(圖3-2)，發現實驗組顆粒半徑變小、存在破碎現象，證明了PE降解的功能存在。

圖3-1 微塑料FT-IR結果

圖3-2 微塑料SEM結果

此外，BNU-China還對自主設計的PEBP(PE binding peptide)進行PE結合實驗，利用綠色熒光蛋白GFP融合標記PEBP，分離純化出蛋白後用塑料孵化，觀察綠色熒光信號(圖3-3)。結果表明PEBP確實具有PE結合能力。

可惜的是，課題組並未能成功表達出PEBP-PEase蛋白，故僅(jin) 用建模軟件預測融合後蛋白結構(圖3-4)，預測結果顯示融合不會(hui) 對兩(liang) 者的功能產(chan) 生影響。

圖3-3 微塑料與(yu) PEBP-GFP結合結果

圖3-4 PEBP-PEase結構預測

電子傳(chuan) 遞 功能驗證

BNUZH-China用NADH Assay Kit和WST-8測量了NADH和NAD+濃度(圖3-5)。結果表明導入nqrf確實提高了 NADH還原酶 活性，提高了 吩嗪還原酶 活性，其理論的電子傳(chuan) 遞效果會(hui) 更佳。

BNUZH-China還用銀染法標記菌毛，鏡檢結果(圖3-6)表明pilA有效提高了菌毛長度。

圖3-5 nqrf對菌內(nei) NADH 與(yu) NAD+ 影響

圖3-6 pilA對菌毛長度影響

此外，課題組通過測量細菌液的電導率MFC，發現實驗組電導率電導率均提升，說明所導入質粒發揮作用，且隨著時間增加，電子通過鞭毛傳(chuan) 遞增強並後續保持在一個(ge) 高值。

圖3-7 narf、pilA工程菌電壓隨時間的變化趨勢

CO2固定 功能驗證

BNUZH-China使用FT-IR進行纖維素生產(chan) 驗證(圖3-8)，發現實驗組纖維素的特征峰(如3300-3500cm⁻¹的 -OH 振動、1100-1030cm⁻¹的 C-O-C 振動)明顯，對照組因產(chan) 量低未檢測到明顯信號，說明構建工程菌可以產(chan) 生纖維素。

此外，他們(men) 通過剛果紅染色發現工程菌 DH5α/pBBR1MCS2-bcsA-bcsB染色後出現紅色複合物，而空載體(ti) (DH5α/pBBR1MCS2)和野生型(DH5α)無顯著紅色，證實纖維素合成功能。(圖3-9)

可惜的是，課題組因工期不足，雖成功構建nadM-nadK-pntA-pntB質粒係統，但未能完成實際的固碳功能檢驗。

圖3-8 纖維素含量的FT-IR測定

圖3-9 菌落纖維素含量 Congo Red 染色結果

圖3-10 nadM-nadK-pntA-pntBPCR產(chan) 物電泳結果

自殺係統 功能驗證

為(wei) 了驗證工程菌中自殺係統對檸檬酸鹽濃度的敏感性、自殺係統殺滅工程菌的能力，BNUZH-China構建了兩(liang) 種功能質粒。其中，pAB1-PopdH用於(yu) 驗證啟動子 PopdH對環境檸檬酸濃度存在感應， pAB1-hok/sok則用於(yu) 驗證自殺係統殺滅能力和維持質粒穩定性的能力。

為(wei) 驗證該係統對質粒丟(diu) 失的影響，該團隊進行了傳(chuan) 代培養(yang) 。在含Amp抗性的LB培養(yang) 基中，分別接種攜帶或未攜帶hok/sok係統的菌株。結果(圖3-11-B)顯示含hok/sok係統的菌株質粒保留率顯著高於(yu) 對照組，表明該係統有效抑製質粒丟(diu) 失。

圖3-11 抗丟(diu) 失功能檢測結果

為(wei) 了驗證自殺係統中啟動子 PopdH對檸檬酸鹽濃度敏感性，該實驗通過梯度檸檬酸濃度實驗(0-5mM)檢測熒光強度(圖3-12)。結果顯示，未添加檸檬酸的組別無熒光信號，而 5mM 檸檬酸組熒光最強，結果證實 PopdH可被檸檬酸特異性激活，並實現環境濃度依賴性基因調控。

圖3-12 PopdH功能驗證結果

為(wei) 了驗證自殺係統的工作能力，研究者利用IPTG代替檸檬酸鹽環境含量的變化(pLac替換PopdH)，結果顯示具有 IPTG 的組 OD600 遠高於(yu) 另一組(圖3-13, 3-14)，即菌密度更高，意味著 IPTG 能夠誘導SOK的表達。因此，自殺的係統是有效。

圖3-13 IPTG模擬檸檬酸實驗的培養(yang) 管

圖3-14 IPTG模擬檸檬酸實驗結果

共培養(yang) 驗證

由於(yu) 本課題的兩(liang) 種工程菌需要共同施布，BNUZH-China設計了相關(guan) 實驗探究這兩(liang) 種工程菌在共培養(yang) 條件下對彼此的影響。

他們(men) 自行配製了體(ti) 積比為(wei) 1:1的LB培養(yang) 基與(yu) ATYP培養(yang) 基混合的共培養(yang) 體(ti) 係，並進行72小時生長曲線測試。生長曲線結果顯示(圖3-15)，兩(liang) 種菌在共培養(yang) 體(ti) 係中均能有效生長，且銅綠假單胞菌生長速度更快，符合實際生物學特性，證明共培養(yang) 實驗達到預期，為(wei) 後續電壓測試奠定基礎。

圖3-15 PAO1 & CGA009 共培養(yang) 生長曲線

為(wei) 了測試細胞外電子是否能在兩(liang) 種菌種之間都能高效開展轉移，BNUZH-China在單獨培養(yang) 銅綠假單胞菌一段時間後加入沼澤紅單胞菌，並檢測電壓變化。發現含pilA的工程菌初始產(chan) 生較高電壓(約15000mV)，表明其代謝活躍；但加入沼澤紅假單胞菌後電壓顯著下降並趨於(yu) 穩定波動，表明兩(liang) 菌間可能存在電子傳(chuan) 遞，導致電壓響應減弱。

另一組實驗中，攜帶nqrf基因的工程化沼澤紅假單胞菌相較於(yu) 對照組電壓更強，但溶液電導率未顯著變化。推測原因可能與(yu) 陽離子交換膜長時間浸泡導致性能下降有關(guan) 。

圖3-16

IV. Hardware

在硬件部分，BNUZH-China設計了 PE 微塑料含量檢測測試盒，便於(yu) 長期評價(jia) 環境中的微塑料含量(圖4-1)。更多詳細內(nei) 容見2024wiki的hardware板塊。

圖4-1 土壤 PE 含量檢測測試盒工作流程

V. HP

在HP部分，團隊工作分為(wei) 三塊。

一、綜合性實踐。引入三重底線模型和利益相關(guan) 者互動工具，分析項目全麵性和可行性，通過iHP循環吸引利益相關(guan) 者反饋，持續改進項目。

二、社會(hui) 教育。開展社區細胞模型活動、高校合成生物學競賽等，培養(yang) 環保意識，激發科學興(xing) 趣，呼籲關(guan) 注紅樹林保護和微塑料汙染。

三、CO₂合作。與(yu) 其他iGEM團隊、非營利組織合作，舉(ju) 辦研討會(hui) 、保護活動等，擴大影響力，共享資源，開發創新解決(jue) 方案。