課題：2019 BOKU-Vienna
主要內(nei) 容：
布魯裏潰瘍是由潰瘍分枝杆菌引起的傳(chuan) 染病，引起這種疾病的罪魁禍首為(wei) 黴菌內(nei) 酯。這種細菌代謝物會(hui) 削弱宿主的免疫反應，從(cong) 而導致病變和組織死亡。對於(yu) 這種疾病，使用靶向抗生素進行早期治療對於(yu) 完全康複至關(guan) 重要，所以該課題組著眼於(yu) 診斷工具的開發，希望能夠快速簡單地實現對布魯裏潰瘍的診斷。檢測的基本原理為(wei) RNA適配子結合黴菌內(nei) 酯後其構象會(hui) 改變，該課題組進而探索黴菌內(nei) 酯與(yu) 適配子的特定相互作用，尋找具有檢測潰瘍分枝杆菌潛力的RNA適配子，實現對潰瘍分枝杆菌的檢測。
關(guan) 鍵詞：布魯裏潰瘍，診斷，RNA適配子，黴菌內(nei) 酯
1 課題背景
該課題組針對的疾病是一種被忽視但其實在熱帶地區影響較大的熱帶病，一種在非洲和南美洲部分地區難以檢測的疾病——布魯裏潰瘍。布魯裏潰瘍是由潰瘍分枝杆菌引起的傳(chuan) 染病，引起這種疾病的罪魁禍首為(wei) 黴菌內(nei) 酯，這種細菌代謝物會(hui) 削弱宿主的免疫反應，從(cong) 而導致病變和組織死亡。雖然布魯裏潰瘍的死亡率很低，但許多治愈的患者不僅(jin) 表現出皮膚的持久變形，而且表現出骨骼的持久變形。毫無疑問，關(guan) 注這種被忽視的疾病是有意義(yi) 的。
對於(yu) 這種疾病，使用靶向抗生素進行早期治療對於(yu) 完全康複至關(guan) 重要，所以該課題組著眼於(yu) 診斷工具的開發。根據需求，該課題組需要找到一種可靠，廉價(jia) 和簡單的檢測方法，不需要專(zhuan) 業(ye) 人員，設備齊全的實驗室和漫長的檢測時間。因此該課題組開始深入研究布魯裏潰瘍的致病因子及其生產(chan) 者，並研究診斷中潛在的新方法。了解到黴菌內(nei) 酯是布魯裏潰瘍的致病因子，並且它是一種大環內(nei) 酯，於(yu) 是該課題組利用一種稱為(wei) 適配子的RNA，如果存在黴菌內(nei) 酯，RNA配子會(hui) 改變其構象。基於(yu) 這個(ge) 原理，該課題組開發了他們(men) 的檢測係統。
2 核糖開關(guan)
該課題組對大腸杆菌菌株DH10B進行遺傳(chuan) 修飾，將其設計成在存在潰瘍分枝杆菌的情況下就會(hui) 產(chan) 生特定信號，示意圖如下（圖1）。該係統能夠通過黴菌內(nei) 酯與(yu) 適配子序列特異性結合來檢測黴菌內(nei) 酯。當存在黴菌內(nei) 酯時，應在測試微生物中誘導發生顏色反應，實現快速而清晰的檢測。電路中還應加入信號增強器，以提高檢測限。
圖1
該檢測係統的關(guan) 鍵為(wei) 適配體(ti) 核糖開關(guan) 的設計。沒有信號輸入時，適配子序列與(yu) 終止子序列結合形成發夾結構，RNA聚合酶上的蛋白質與(yu) 發夾結合，從(cong) 而停止轉錄，核糖開關(guan) 此時處於(yu) 關(guan) 閉模式；如果存在黴菌內(nei) 酯，發夾結構就會(hui) 打開， RNA聚合酶轉錄出信號分子mRNA。該課題組根據基於(yu) 發卡結構的核糖開關(guan) 設計了兩(liang) 種回路。
第一種回路（圖2）：
適配體(ti) 結合黴菌內(nei) 酯後，組成型啟動子誘導LuxI和LuxR的表達，LuxI-LuxR複合物誘導Lux誘導型啟動子表達更多LuxI（表達LuxI可以進一步放大信號）和報告蛋白——藍色色素蛋白（amilCP）。同時LuxI產(chan) 生的分子N-酰基高絲(si) 氨酸內(nei) 酯（AHL），AHL可以被釋放到環境中並被其他細胞接收，激活更多Lux啟動子。綠色熒光蛋白（GFP）由LacI / T7啟動子控製，將乳糖添加到培養(yang) 基中，GFP將被表達，該回路用作係統的可行性控製。
圖2
第二種回路（圖3）：
黴菌內(nei) 酯與(yu) 適配子結合後組成型啟動子誘導時T7-聚合酶的表達，隨後T7-聚合酶誘導LuxI的表達，其與(yu) 組成型啟動子誘導的LuxR形成LuxI-LuxR複合物。這種複合物誘導Lux誘導型啟動子，激活了藍色色素蛋白（amilCP）的表達。信號放大的方式與(yu) 第一種回路的方法相同。同時該表達係統含有阿拉伯糖啟動子。通過將阿拉伯糖添加到培養(yang) 基中，將誘導綠色熒光蛋白的表達，該回路用作可行性控製，證明整個(ge) 係統是具有檢測活力的。
圖3
由於(yu) 該課題組信號放大的方法借助了群體(ti) 感應，所以該課題組另外構建了一個(ge) 沒有群體(ti) 感應模塊的係統（圖4），以防萬(wan) 一這個(ge) 檢測係統的某些部分不起作用。這個(ge) 係統由組成型啟動子誘導時T7-聚合酶的表達，並通過T7-Promtor進一步誘導amilCP的表達，同時阿拉伯糖誘導的GFP信號回路也存在於(yu) 該係統中。
圖4
該課題組的實驗結果證明由於(yu) 黴菌內(nei) 酯與(yu) 特定適配體(ti) 序列的結合誘導核糖開關(guan) 啟動，該核糖開關(guan) 對黴菌內(nei) 酯具有高度特異性。此外，該係統產(chan) 生的信號是一個(ge) 簡單的視覺讀數，讀取信號時隻需人眼觀察即可。最重要的是，該檢測係統對於(yu) 黴菌內(nei) 酯的檢測限顯著降低。該課題組希望對他們(men) 的係統作進一步的改進，包括一個(ge) 更詳細的上調和信號增強機製，使得一個(ge) 黴菌內(nei) 酯分子的存在並且與(yu) 一個(ge) 細胞中的一種適配體(ti) 的結合後，就可以誘導信號輸出，進一步降低他們(men) 的檢測限。
3 課題結果
該課題組創建了一種黴菌內(nei) 酯核糖開關(guan) ，該開關(guan) 在轉錄水平上工作 。他們(men) 的適配體(ti) 是從(cong) 論文中選取的，最終對比了多篇文獻後，該課題組選擇了最適宜的適配體(ti) 序列（適配體(ti) 3683）並設計了多個(ge) 固有端接方案，之後他們(men) 將適配體(ti) 序列添加到啟動子和RBS中間以創建複合部件。將適配體(ti) 放置在啟動子和RBS之間非常重要，因為(wei) DNA的發夾結構可以在轉錄之前阻止RNA聚合酶結合到RBS上，適配子結合目標後，發卡結構打開，RNA聚合酶得以與(yu) RBS結合；為(wei) 了測量該係統的泄漏GFP 被添加到複合部件的下遊。
在不添加黴菌內(nei) 酯的情況下測量GFP產(chan) 生，可以在體(ti) 內(nei) 研究該係統的泄漏情況。在37°C下孵育15小時後，測量未添加黴菌內(nei) 酯時係統的熒光，以及測量試劑盒中的熒光素標準品，以將核糖開關(guan) 的淨平均熒光轉換為(wei) 每個(ge) 細胞分子的熒光。將來自未添加黴菌內(nei) 酯時係統的算術淨平均熒光4733.22放入曲線方程中，以計算OD600處320 nM的濃度=3.65, 這相當於(yu) 每個(ge) 細胞大約66，000個(ge) 熒光分子。
該課題組經過實驗發現，黴菌內(nei) 酯的誘導在體(ti) 內(nei) 不起作用，因此，該課題組利用了myTXTL® Sigma 70 Master Mix試劑盒對他們(men) 的係統進行了無細胞的測試。在無細胞條件下的測試表明，黴菌內(nei) 酯適配子核糖開關(guan) 可以在無細胞係統上發揮作用，因為(wei) 該課題組們(men) 在用黴菌內(nei) 酯誘導後觀察到了GFP的產(chan) 生。
總結來說，該課題組設計了一種基於(yu) 核糖開關(guan) 的檢測方法，檢測結果可以用肉眼觀察。核糖開關(guan) 使用了基於(yu) 適配體(ti) 的T7-聚合酶和T7-啟動子控製下遊基因的表達。
4 Human Practice
來自不同利益相關(guan) 者的見解和反饋從(cong) 一開始就強烈影響了該課題組項目的發展。在調查了布魯裏潰瘍研究和它在國際中的地位之後，該課題組聯係了醫學科學專(zhuan) 家，醫療保健提供者，分子生物學家，倫(lun) 理學家，社會(hui) 科學家和前患者，以討論和微調他們(men) 的係統。該課題組展示了他們(men) 是測試套件和手冊(ce) ，它們(men) 是根據與(yu) 專(zhuan) 家和實驗室團隊的交流精心起草的。
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