IGEM競賽文獻分享 PNAS: Cas1–2/3複合物的結構及調節作用

文獻標題：

Cas1 and the Csy complex are opposing regulators of Cas2/3 nuclease activity

DOI號：

https://doi.org/10.1073/pnas.1616395114

關(guan) 鍵詞：

Cas2/3，Cas1，CRISPR I-F

1.背景

CRISPR有6種型（type I-VI），19種亞(ya) 型。Type I是最常見的一種類型，有7種亞(ya) 型（subtype I-A to I-F，and I-U），這7中亞(ya) 型都依賴於(yu) Cascade來對外源DNA檢測並且都依賴於(yu) Cas3來降解靶向的DNA。Cas3：

N端是HD（histone-aspartate）核酸酶結構域，C端是superfamily II（SF2）解旋酶結構域。

2.Cas1-2/3

Cas1和Cas2對於(yu) 識別和把新的spacer整合到CRISPR-array上是必需的，近期的研究表明，Cas3也參與(yu) adaption的過程。在大腸杆菌(I-E型)中， 4個(ge) Cas1分子和2個(ge) Cas2分子組裝成一個(ge) 複合物。但I-F與(yu) 其他I型係統不同的是，Cas2和Cas3是融合的，也可以說， Cas2和Cas3的融合是I-F的獨特特征(P.S.有的文獻用Cas2/3表示Cas2和Cas3的融合，有的文獻用Cas2-3來表示Cas2和Cas3的融合，這裏統一用Cas2/3來表示)。

接下來就簡要介紹一下融合的Cas2/3結構和Cas2/3：

（1）Cas2和Cas3在gene層麵融合：

I-F型Cas2和Cas3在gene層麵就是融合在一起的，表達出來是一個(ge) 單一的融合的多肽。Cas2/3中，Cas2在Cas3的N端，和Cas3的HD 核酸酶結構域相連；CTD是指Cas3的C端結構域，具有解旋功能；Rec是解旋酶結構域。

（2）Cas1-2/3三級結構：Cas14:Cas2/32

研究發現，4個(ge) Cas1和2個(ge) Cas2/3會(hui) 組合在一起起作用，簡寫(xie) 為(wei) Cas14:Cas2/32。結構圖見下D、E、F圖：

簡單來說就是，兩(liang) 個(ge) Cas2/3分子與(yu) 四個(ge) Cas1分子組裝成一個(ge) 四葉螺旋槳狀結構，其中兩(liang) 個(ge) Cas2結構域（Cas2 dimer）形成一個(ge) 中心樞紐（兩(liang) 個(ge) 對稱軸），兩(liang) 側(ce) 有兩(liang) 個(ge) Cas1葉和兩(liang) 個(ge) Cas3葉。比較重要、需要說明結構特征還有以下兩(liang) 點：

（1）Cas1和 Cas3的CTD區域結合。這可能和Cas1對Cas2/3功能的調控相關(guan) ；

（2）Cas2/3融合蛋白的Cas2結構域與(yu) Cas3解旋酶的RecA1結構域相互作用，而Cas3的CTD在Cas1的螺旋結構域上補充了形狀和電荷。CTD與(yu) DNA結合和靶標降解有關(guan) ，這種相互作用進一步表明Cas1可能影響Cas3的功能。

3. Cas2/3的性能和其活性的調控

為(wei) 了驗證Cas2/3的性能和調控它的東(dong) 西，分別純化了Cas2/3，Cas1，Cascade、AcrF等蛋白，檢驗Cas2/3在各種條件下體(ti) 外降解模擬了R-loop的DNA（就是在dsDNA中做出一個(ge) bubble來模擬R-loop、做出ssDNA的狀態）。具體(ti) 如下圖：

圖解：

A-G都是體(ti) 係中加入不同的蛋白的降解結果，具體(ti) 加的是哪些蛋白看H圖的注釋，那個(ge) 百分比值指的是DNA降解程度；H圖中，橫軸表示體(ti) 係中加的蛋白，縱軸表示DNA被降解成碎片的比例（破碎程度）。Csy指的就是Cascade，apoCsy就是帶的crRNA不能和體(ti) 係中的R-loop配對的Cascade，AcrF指的就是anti-CRISPR係統表達出的能和Cas2/3結合、阻止Cascade招募Cas2/3的蛋白。

結果表明：

（1）單獨的Cas2/3可以對ssDNA進行降解

（2）Cas1抑製Cas2/3的核酸酶活性

之前提到了，Cas1能和 Cas3的CTD區域結合。Cas1將CTD穩定在一個(ge) 封閉的構象中，從(cong) 而限製DNA進入HD活性位點，從(cong) 而起到抑製Cas2/3活性的作用。但Cas1對Cas2/3的結合並不影響Cascade對Cas2/3的招募作用

（3）Cascade激活Cas2/3的核酸酶活性，激活之後，Cas2/3結合到遊離的ssDNA上，按3’-5’的方向降解

（4）AcrF並不直接抑製Cas2/3的核酸酶活性，而是通過抑製Cascade對Cas2/3的招募作用來抑製CRISPR進行interference的能力

同時，研究者發現，在沒有加Cascade的組，由於(yu) 沒有指引，Cas2/3無法精準定位到DNA的具體(ti) 位置上，對ssDNA區域的剪切是斷斷續續的；加了Cascade的組則會(hui) 對R-loop從(cong) 頭到尾的精準剪切破碎。

4.Cascade招募Cas2/3

就是說在interference中起作用的是Cas2/3，所以在interference時，Cas1會(hui) 從(cong) Cas1:Cas2/3上脫離下來；但Cas1-Cas2/3仍舊是具有剪切活性的。

5.Cas2/3能剪切dsDNA——和I-F的bidirectional spacer acquisition功能適配

在interference過程中，Cas2/3會(hui) 對兩(liang) 條鏈都進行剪切，但對遊離出來的那條ssDNA的剪切效率（文章的數據是85%）要比另一條和Cascade結合的（文章的數據是20%）高很多。