iGEM課題分享——2024 CAU-China

iGEM課題分享

Nodule Factory

iGEM 2024 CAU-China

獲獎情況

在2024年iGEM大賽中，CAU-China榮獲金獎及最佳食物&營養(yang) 課題，並獲得最佳生物元件組合設計及最佳可持續發展兩(liang) 個(ge) 單項獎的提名。

01、Background

因經濟拮據而無力負擔健康膳食，是全球三分之一以上人口麵臨(lin) 的嚴(yan) 峻問題。其造成的營養(yang) 不良會(hui) 進一步導致低收入，形成惡性循環。能適應貧瘠的土壤條件的豆科植物，在世界範圍內(nei) 被廣泛種植，而其根部的共生組織，根瘤，具有天然的微好氧環境，如果能在其中生產(chan) 這些微好氧營養(yang) 物質，可以達到同時解決(jue) 營養(yang) 不良與(yu) 低收入的雙重困境的效果。

因此，CAU-China開發了Nodule Factory，運用合成生物學改造根瘤菌，使其具備生產(chan) EPA和DHA的能力，並設想可以通過跨膜運輸，將根瘤中的營養(yang) 物質運送到大豆中，讓人們(men) 便捷實惠地攝取營養(yang) 。

全球豆科植物產(chan) 量

CAU-China開發了一個(ge) 開源的微好氧生產(chan) 平台，並驗證了根瘤微氧生產(chan) 物質的可行性，未來的隊伍隻需在現有基礎上略微改造，就可以合成其他想要的產(chan) 物。

02、Design

*設計總覽

CAU-China選擇費氏中華根瘤菌CCBAU45436作為(wei) 底盤，構建了一套響應氮和氧變化的調節模塊，並利用編碼PUFA合酶和二肽醛的基因，初步證明了“微需氧工廠”的可行性。為(wei) 了提高其效率，他們(men) 通過調整相關(guan) 基因的表達對新陳代謝進行重編程，並設計了自殺回路以避免底盤泄漏。

Ⅰ.阻斷PHB合成

PHB（聚-β-羥丁酸） 是根瘤菌的內(nei) 源性代謝產(chan) 物，在野生型中表達量很高。phaC2編碼的PHB合酶是PHB合成途徑下遊的關(guan) 鍵酶。

*相關(guan) 代謝通路

CAU-China利用同源重組雙交換技術敲除phaC2，導致底盤PHB合成下降，減少對乙酰輔酶A的消耗，為(wei) PUFA 的合成提供足夠的底物。

Ⅱ.調節與(yu) 合成模塊

根據根瘤內(nei) 部的微需氧環境，CAU-China設計了一個(ge) 響應氮氧濃度的調節模塊。

glnK啟動子和nifH啟動子是底盤中的兩(liang) 種內(nei) 源誘導型啟動子。其中glnK啟動子在低氮條件下會(hui) 啟動下遊基因的表達，nifH啟動子在低氧條件下會(hui) 啟動下遊基因的表達。此外，他們(men) 引入了CRISPRi，在底盤中表達一種無核酸酶活性的Cas12k蛋白，令其在sgRNA的指導下可逆地與(yu) 靶序列結合而不會(hui) 切割它們(men) ；通過Cas12k與(yu) 下遊基因的結合和解離，實現基因表達的開關(guan) 。

本模塊的CRISPRi係統與(yu) 誘導型啟動子共同形成了 “AND gate” 調控模式，實現了對下遊基因的更精準調控。

調節的具體(ti) 方式為(wei) ：高氧和低氮下表明根瘤菌是遊離的，在低氧和低氮下表明根瘤菌此時需要將較多物質和能量投入固氮功能，這兩(liang) 種情況下，合成模塊應當受到抑製，因此glnK啟動子被低氮環境激活並啟動sgRNA-GFP的表達，引導組成型表達的Cas12k與(yu) gfp基因結合並阻斷下遊基因的轉錄。

而到了植物生長後期，補充施用氮肥提高了土壤中的氮濃度，從(cong) 而降低了glnK啟動子的活性，因此sgRNA-GFP的表達降低，從(cong) 而實現在缺氧條件下由nifH啟動子引發的下遊合成基因的表達。

調節的具體(ti) 方式為(wei) ：高氧和低氮下表明根瘤菌是遊離的，在低氧和低氮下表明根瘤菌在根瘤中發揮固氮功能，這兩(liang) 種情況下，合成模塊應當受到抑製，因此glnK啟動子被低氮環境激活並啟動sgRNA-GFP的表達，引導組成型表達的Cas12k與(yu) gfp基因結合並阻斷下遊基因的轉錄。

而到了植物生長後期，補充施用氮肥提高了土壤中的氮濃度，從(cong) 而降低了glnK啟動子的活性，因此sgRNA-GFP的表達降低，從(cong) 而實現在缺氧條件下由nifH啟動子引發的下遊合成基因的表達。

在合成模塊，該項目以二肽醛和PUFA為(wei) 目標產(chan) 物驗證根瘤工廠的功能。其中，bgc33-sfp編碼一種非核糖體(ti) 肽合成酶（NRPS），該酶催化二肽醛的合成；pfa生物合成基因簇編碼催化DHA和EPA等長鏈多不飽和脂肪酸合成的PUFA 合成酶。他們(men) 還在pfa生物合成基因簇中添加了底盤內(nei) 源性RBS，並優(you) 化了密碼子偏好，以提高該模塊的表達效率。

*響應環境中氮氧濃

度並調控產(chan) 品合成

Ⅲ.自殺係統設計

CAU-China創新性地結合了CRISPRi係統和底盤內(nei) 源性的毒素-抗毒素（TA）係統，將這些組分與(yu) 調節模塊中選取的誘導型啟動子結合，這樣就可以根據係統外部環境條件實現精確調節。

在該模塊，編碼毒素的vapC為(wei) 組成型表達，編碼抗毒素的vapB受啟動子nifH調節。在高氧條件下，vapB的表達受到抑製。如果此時處於(yu) 低氮條件下，CRISPRi係統被激活，vapC的表達也被抑製；而當根瘤菌從(cong) 共生環境中逸出，進入高氮高氧的外部環境時，vapC會(hui) 正常表達，而vapB繼續受到高氧條件的抑製。這導致毒素水平超過抗毒素的耐受閾值，最終觸發根瘤菌的自毀。

03、Result

Ⅰ.同源重組敲除phaC2

選取phaC2上下遊各500bp構建“Up-Arm phaC2 + Down-Arm phaC2”同源區段，利用三親(qin) 交配法將載體(ti) 轉入底盤中， 根據菌落PCR，突變菌株中成功截短了目的序列。

接種栽培十五天後，各組葉綠素含量和地上幹重無明顯差距（左圖）；又做栽培21天的實驗，結果顯示接種的∆phaC2突變體(ti) 不影響作物地上部分的生長（右圖）。

為(wei) 了確保PHB合成被順利阻斷，他們(men) 利用透射電鏡觀察菌體(ti) 內(nei) PHB顆粒的分布，結果顯示∆phaC2突變體(ti) 中的PHB合成確實受到了顯著抑製。

最後，他們(men) 使用薄層色譜法分析重組菌株中三酰甘油（TAG）的量，指征脂肪酸含量。可見∆phaC2突變體(ti) 中TAG含量顯著增加，證明phaC2基因的缺失可提高乙酰CoA水平進而促進脂肪酸合成。

Ⅱ.調節模塊

CAU-China首先對glnK啟動子進行單獨驗證。他們(men) 構建了“啟動子+熒光蛋白”係統，將其轉入大腸杆菌DH5α，利用無氮M9培養(yang) 基進行培養(yang) 並建立氯化銨濃度梯度，孵育過夜後測定OD600值以及菌液的熒光強度。顯然，無氮條件下熒光強度顯著高於(yu) 所有含氮組，證明glnK可在低氮誘導下啟動表達。

隨後他們(men) 對nifH啟動子進行驗證。他們(men) 構建了nifH+gfp並與(yu) glnK+sgRNA-GFP一起進行無縫克隆，隨後在1g/L NH4Cl的M9培養(yang) 基中培養(yang) 該質粒轉化的根瘤菌，高氮環境將使glnK啟動子無法表達crispri係統。分別在低氧和高氧條件下孵育 24 小時後，檢測熒光強度，成功驗證了nifH啟動子被高氧條件抑製。

通過三親(qin) 接合法將構建好的調控模塊導入根瘤菌後，係統在不同環境條件下的響應表現出高度特異性。他們(men) 設置了高氮高氧、低氮高氧、高氮低氧以及低氮低氧四組對根瘤菌進行孵育，測定熒光強度及OD600值。在高氧條件下，nifH啟動子受到抑製；在低氮條件下，glnK啟動子得到促進，sgRNA的表達上調，指導Cas12k蛋白抑製熒光蛋白的表達，在最佳誘導條件（高氮低氧）下表達強度最高。

但在預期結果之外的是，低氮和高氧條件下都誘導了高表達，推測這是啟動子的組成型表達不受抑製造成的，也存在泄漏表達的可能。

Ⅲ.合成模塊

首先，為(wei) 了驗證質粒是否會(hui) 對根瘤的生長造成應激，CAU-CHINA利用nifH啟動子與(yu) 完整或一半的二肽醛合成基因簇構建複合回路。接種21天後，兩(liang) 種重組菌處理組的地上部分幹重均顯著降低，表明外源基因表達可能對宿主產(chan) 生了代謝負擔，但二肽醛合成基因簇是否完整對此並無影響。

他們(men) 從(cong) bgc33基因上與(yu) 啟動子距離逐漸增加的位置設計了三對引物，檢測不同部位的表量。RT-qPCR結果顯示，bgc33基因的轉錄效率隨其與(yu) 啟動子距離的增加呈梯度下降趨勢，距離每增加1kb轉錄水平下降約40%。

在產(chan) 物驗證中，質譜分析隻可在原液中檢測到目標產(chan) 物的特征峰，濃度僅(jin) 為(wei) nM級別。結合RT-qPCR結果，轉錄水平較低、mRNA半衰期縮短是導致產(chan) 物積累不足的主要原因。

隨後，他們(men) 針對多不飽和脂肪酸（PUFA）的合成進行驗證。可惜的是，按設計完成分子克隆後，他們(men) 測序發現了幾個(ge) 無義(yi) 突變和點突變，隻好在修複突變後又設計了一個(ge) 利用nuoA組成型表達的簡易線路，成功實現重組質粒在大腸杆菌中的組裝和表達。

RT-qPCR結果顯示pfa基因整體(ti) 表達上調，尤其靠近啟動子一端表達較高，而遠端基因表達下降，可能因mRNA降解或轉錄後結構不穩定所致。

雖然在重組菌株原液中沒有鑒定出DHA和EPA的存在，但薄層色譜分析顯示三酰甘油含量提升，而氣相色譜進一步發現一種在野生型中未檢測到的十四碳飽和脂肪酸，提示合成模塊具有部分生物合成功能。

最終的脂肪酸組成分析表明，+pfa菌株中不飽和脂肪酸占比顯著下降，尤其在C18係列中，表明可能存在還原酶過度表達造成的去不飽和化現象。

雖然未能檢測到目標產(chan) 物DHA和EPA，但實驗結果從(cong) 多個(ge) 層麵展示了pfa基因簇在異源宿主中具有表達能力，並能驅動新脂肪酸的合成。

Ⅳ.自殺模塊

通過熒光強度和OD600值變化對自殺模塊功能進行功能驗證。在低氧條件下，不同氮濃度引起熒光表達顯著變化，符合係統設計預期；而在高氧條件下，氮濃度對表達影響減弱，可能因毒素表達擾亂(luan) 環境所致。OD600監測結果顯示，隨氮源濃度升高，菌液密度明顯下降，支持模塊能在高氮條件下誘導細胞死亡。

最後，菌落表型觀察發現，在高氮高氧環境下長期培養(yang) ，會(hui) 導致重組菌株在固體(ti) 培養(yang) 基上逐漸由乳白色變為(wei) 透明，說明毒素表達導致菌落死亡，進一步驗證自殺回路在特定條件下能有效啟動。該係統為(wei) 根瘤共生細菌中合成生物學元件的精確調控與(yu) 生物安全控製提供了有力工具。

04、Dry Lab

CAU-China建立了一係列數學模型，包括豆科植物根中根瘤菌感染和根瘤形成的模型，氮調節蛋白-DNA 對接模型、氮擴散模型、兩(liang) 個(ge) 預測 DHA 合成的模型和一個(ge) 自殺回路模型。並且開發了POMPC軟件（Prediction Of

Metabolism Pathway Changes）通過輸入相關(guan) 底物濃度來直接訪問預期產(chan) 物的含量，性能良好，應用範圍廣，無需聯網且對非專(zhuan) 業(ye) 用戶友好，輸入底物可查詢相關(guan) 通路。

CAU-CHINA為(wei) 模擬中華根瘤菌在大豆根部的侵染及根瘤形成過程，構建了一個(ge) 三維細胞自動機（3D CA）模型，以此估算根瘤中細菌數量，從(cong) 而為(wei) DHA產(chan) 量預測提供定量依據。模型基於(yu) 文獻中描述的標準感染流程，抽象出多個(ge) 關(guan) 鍵狀態並製定狀態轉換規則，涵蓋細菌附著、感染絲(si) 形成、根瘤發育和固氮等階段。

在模型構建中，CAU-CHINA設置了包括根細胞、自由菌、附著菌、感染絲(si) 、根瘤細胞和固氮細胞在內(nei) 的七種狀態，使用摩爾鄰域實現空間傳(chuan) 播，並設置理想化的圓柱形根結構作為(wei) 細菌附著平台。通過對鄰近狀態的判斷與(yu) 概率控製，模型可逐步演化出符合實際過程的結節形成動態。

模擬結果顯示，在有限初始菌數條件下，根瘤從(cong) 老師圍感染點逐步擴展，最終形成固氮細胞，過程與(yu) 實際觀測一致。通過迭代過程中的狀態計數，CAU-CHINA觀察到感染絲(si) 先增加後穩定，隨後根瘤迅速擴大，最終固氮細胞數量趨於(yu) 飽和，成為(wei) 產(chan) DHA的潛力群體(ti) （圖13）。當初始菌數提升十倍後，根瘤形成速度顯著加快，固氮能力細胞快速積累。

05、HP

人類實踐部分主要分成可持續發展影響（從(cong) 長遠角度測評產(chan) 品等）；綜合人類實踐（對專(zhuan) 家進行采訪）；教育（對中小學進行宣傳(chuan) ）；包容實踐（針對殘障人士的宣傳(chuan) ）。

采訪大田種植技術指導老師胡金彪

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